Анализируя связь между моноцитов и первичных груди раковые клетки в внеклеточного матрикса экстракт (ECME)-на основе трехмерной системы
Summary
Здесь мы описываем трехмерной культуры метод для анализа морфологии первичных груди раковых клеток, а также изучение их прямое/косвенное взаимодействие с моноцитов и исходы, такие как деградация коллагена, набора иммунных клеток, клеток вторжения и поощрение связанных с раком воспаления.
Abstract
Встроенные в внеклеточного матрикса (ECM), нормальных и опухолевых клеток эпителия тесно общаться с кроветворную и не гемопоэтических клеток, таким образом значительно влияющих на нормальные ткани гомеостаза и болезни результатов. В рак молочной железы связанный тумором макрофагов (ТАМС) играют важную роль в прогрессирования заболевания, метастазов и рецидивов; Таким образом понимание механизмов Моноцит chemoattraction микроокружения опухоли и их взаимодействия с опухолевых клеток имеет важное значение для борьбы с этим заболеванием. Здесь мы предоставляем подробное описание системы трехмерного (3D) совместно культуры молочной железы человека клетки рака (BrC) и человека моноцитов. BrC клетки производятся высокий базальный уровень регулируемую активацию, нормальный Т-клеток выражена и выделяется (RANTES), Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), в то время как в со культуре с моноцитов, Интерлейкин (IL) -1 бета провоспалительных цитокинов (ИЛ 1β) и ИЛ-8 обогатились вместе с матрицы металлопротеиназ (СПП) -1, ММП-2 и MMP-10. Этот микроокружения опухоли стромы поощрять устойчивость к anoikis в ККМ 10A 3D Ацинусы как структуры, chemoattraction моноцитов и вторжения агрессивных клеток BrC. Здесь представлены протоколы предоставляют доступную альтернативу изучать коммуникации внутри опухоли и являются примером большой потенциал, который в vitro 3D ячейки системы обеспечивают допросить особенностей опухоли биологии, относящиеся к опухоли агрессии.
Introduction
Биология опухоли является гораздо более сложной, чем считалось ранее. Монтаж доказательств показывает, что опухолевые клетки более чем просто массовая неконтролируемая пролиферирующих клеток; скорее различные неопластических клеток, по-видимому, выполняют различные функции отображения высокой Организации и иерархия в пределах опухоли1. Опухолевые клетки находятся также в интимной связи с не трансформированных клеток: макрофаги, фибробласты, лимфоцитов, адипоциты, эндотелиальные клетки, среди других клеток все погружены в эшафот белки и полисахариды, которые составляют ECM. Многочисленные прямые и косвенные взаимодействия устанавливаются между преобразуется и -трансформированных клеток и с ECM, который оказывает мощное влияние на результат болезни2,3. В конкретном случае BrC особенно важно вскрыть связи BrC клеток с ТАМС, считая, что ТАМС были найдены играть решающую роль в развитии опухоли, увеличивая риск метастазов и рецидивов болезни4 ,5.
Для анализа интра опухолевой взаимодействий и их возможные результаты, новые 3D в vitro подходы были разработаны основанные на использовании ECM экстрактов, которые обеспечивают гораздо более сложные микроокружения, ближе к реальности опухоли биологии, в сравнении с обычные однослойные клеточных культур, в которых клетки растут придает пластика. Петерсен и Bissell6 первая модель доброкачественные и Злокачественные эпителиальные клетки молочной культивированный на базальной мембраны Ламинин богатые и были первыми для описания структуры 3D organotypic, дискриминационные доброкачественные человека эпителиальных клеток молочной железы от их злокачественные коллегами. Десять лет спустя, модель, разработанная Debnath, Мутусвами, и Брюгге7,8,9 предоставляет ценный инструмент для выяснения биологические пути во время злокачественной трансформации железистой ацинусов, такие как большой Ацинусы образование из-за бесконтрольного распространения, делокализация туго Джанкшен белков как доказательства нарушения клеток поляризации и потеря Ацинусы люмен результате ячейки сопротивления anoikis, тип запрограммированной смерти клетки, происходит в Анкоридж зависимых клеток, когда они отсоединить от окружающих ECM. Модели Sameni, Jedeszko и Слоун были сосредоточены на визуализации протеолитической активности клеток, которая тесно связана с инвазивность, другой решающую черта опухоли злокачественными опухолями10,,1112. Эти модели полагаются на белок матрицы, смешанного с различными закаленном флуоресценции белков субстратов (DQ-желатин, DQ-коллаген I и IV DQ-коллаген), в котором флуоресцентные сигналы являются ориентировочными протеолитических деградации коллагена. 3D модели используются также для изучения свойств стволовых клеток как-трансформированных и опухолевые клетки, в котором ячейки агрегатов, также называют сфероидов, может быть культивировали, подвеска или в ECM-подобных белков, допрос механизмы дифференцировки клеток, асимметричные деление клеток, присоединение к ячейке и клетки моторики13,14. Вторжения анализы позволяют тестирование внутренней агрессивность опухоли и выявление молекулы, которые служат в качестве chemoattractants в ходе инвазивные процесс15. В целом, 3D модели представляют доступные диверсификации в пробирке клеток культуры, которая более тесно отразить нормальной и онкогенных ткани морфогенеза.
Мы разработали 3D клетки совместно культуры системы, основанной на вышеупомянутых моделей7,10,11, используя оба человека коммерческие BrC клеточных линий, известных агрессивный потенциал (люминал и тройной негативного типы) и первичной клетки, описаны из BrC пациентов. Мы впервые разработал модель, где неагрессивных (MCF-7) или агрессивным BrC (MDA-MB-231) клетки были совместно культивируемых с U937 моноцитов в выписку внеклеточного матрикса (ECME)-на основе 3D-системы, которая позволила прямой ячеек взаимодействий. Эти совместно культур были использованы для определения, как связь между этими двумя клеток линий влияние транскрипции набор генов, связанных с агрессивным поведением рака. Значительное увеличение числа Стенограмма циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) было отмечено, что совпало с увеличение производства одного из своих продуктов, простагландин E2 (PGE2), вывод, который подчеркнул роль воспаления в прогрессии рака. Увеличение транскрипции ММП также было отмечено, что коррелирует с больше коллагена протеолиза при агрессивных MDA-MB-231 клетки были совместно культивируемых с U937 моноцитов в DQ-коллаген IV-содержащих культур. Следует отметить нашего совместного культур не поддерживает предположение, что механизмы взаимодействия клеток необходимы для деградации коллагена. Скорее, он предложил, что связь между двумя клеток линий был посредничестве секретируемые молекул. Кроме того supernatants, добываемых из этих анализов совместно культуры содержится растворимых факторов, которые дезорганизованы железистой ацинусов, образованный-трансформированных клеток MCF-10A13. Было установлено, что агрессивный и первичных клеток BrC выделяется повышенный уровень Моноцит эозинофилов молекул MCP-1, ГМ-КСФ и RANTES. Таким образом мы изложили 3D культуры, в которой клетки были отделены в ячейку культуры вставок для предотвращения взаимодействия ячеек. Эти культуры были использованы для решения непрямая связь между BrC клетки и моноцитов. Для этих анализов, неагрессивных и агрессивных коммерческих BrC клеточных линий и первичных клеток BrC и три различных типов человека моноциты: коммерческая U937 и THP-1 клетки и первичной моноцитов (PMs), изолированных от периферической крови здоровых доноров (все Моноциты были использованы в государстве не активирована) были использованы. Увеличение концентрации цитокинов ИЛ 1β и IL-8 были замечены обогатиться в сотрудничестве культуры. Аналогичным образом было установлено, что MMP-1, ММП-2 и MMP-10 также были увеличены в BrC клетки Моноцит совместно культур и таким образом укрепления предыдущие выводы14. В этой рукописи точка за точкой процесса первичной изоляции клетки BrC и тестирования в 3D культур представлен наряду с представителем результаты. Эта работа является хорошим примером того, большой потенциал, который в vitro 3D ячейки системы обеспечивают опрос конкретных аспектов опухоли биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эпителиальные клетки растут в 3D пространственной конформации и их взаимодействие с белками ECM является ключевой для ткани гомеостаза. Многие исследования рака были основаны на клетки, выращенных в монослои (2D) и хотя они решающее значение для понимания многих аспектов образования опух…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа было поддержано КОНАСИТ FONSEC SSA/ИМСС/ИСОГС проекта № 233061 до Эсекьель м. Фуэнтес-Pananá и по Fondo de Apoyo а-ля инвестигасьон, больница Infantil де Мехико Федерико Гомес (номер проекта HIM-2014-053). Эспиноса-Санчес NA является докторантом из Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma де Мехико (UNAM) и получил стипендий 231663 от КОНАСИТ. E-S NA, также признаем финансовую поддержку, оказываемую Мексиканского института социального обеспечения (мисо).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
