Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System
Summary
Hier beschreiben wir eine dreidimensionale Kultur-Methode, um die Morphologie des primären Brustkrebs-Zellen, sowie deren direkte/indirekte Wechselwirkungen mit Monozyten und die Ergebnisse wie Kollagen-Abbau, Immunzelle Rekrutierung, Zelle studieren analysieren Invasion, und Förderung der Krebs-in Verbindung stehenden Entzündung.
Abstract
Eingebettet in die extrazelluläre Matrix (ECM), normale und neoplastische epitheliale Zellen eng mit hämatopoetischen und nicht blutbildenden Zellen so stark beeinflussen Normalgewebe Homöostase und Krankheit Ergebnis kommunizieren. Bei Brustkrebs spielen Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) eine entscheidende Rolle im Krankheitsverlauf, Metastasierung und Wiederholung; Daher ist es wichtig zur Bekämpfung der Krankheit, Verständnis der Mechanismen des Monocyte Chemoattraction Tumor Mikroumgebung und deren Wechselwirkungen mit Tumorzellen. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines dreidimensionalen (3D) Kokultur Systems von menschlichen Brustkrebszellen (BrC) und menschlichen Monozyten. BrC-Zellen produziert hohe basale geregelten auf-Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert (RANTES), Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), während in Kokultur mit Monozyten, Pro-inflammatorische Zytokine Interleukin (IL) -1 Beta (IL-1β) und IL-8 wurden zusammen mit Matrix-Metalloproteinasen (MMP)-1, MMP-2 und MMP-10 bereichert. Dieser Tumor Stroma Mikroumgebung gefördert Widerstand gegen Anoikis in MCF-10A 3D Azini-ähnliche Strukturen, Chemoattraction von Monozyten und Invasion der aggressiven BrC Zellen. Die hier vorgestellten Protokolle bieten eine kostengünstige Alternative zur Intra-Tumor Kommunikation studieren und sind ein Beispiel für das große Potenzial, das in-vitro- 3D Zellsysteme bereitstellen, um die Besonderheiten der Tumorbiologie im Zusammenhang mit Tumor zu verhören Aggression.
Introduction
Tumorbiologie ist weit komplizierter, als bisher angenommen. Montage Beweise zeigt, dass Tumorzellen mehr als eine bloße Bulk unkontrolliert wuchernde Zellen; Vielmehr scheinen verschiedene neoplastische Zellen verschiedene Aufgaben anzeigen hoher Organisation und Hierarchie innerhalb der Tumor-1. Tumorzellen sind auch in intime Kommunikation mit nicht-transformierten Zellen: Makrophagen, Endothelzellen, Fibroblasten, Lymphozyten, Fettzellen zwischen den anderen Zellen sind alle eingetaucht in das Gerüst Proteine und Polysaccharide, die das ECM darstellen. Zahlreiche direkte und indirekte Wechselwirkungen entstehen zwischen den transformierten und nicht-transformierten Zellen und mit der ECM, die einen starken Einfluss auf die Krankheit Ergebnis2,3ausübt. Im konkreten Fall des BrC ist es besonders wichtig, die Kommunikation der BrC Zellen mit TAMs, wenn man bedenkt, dass TAMs gefunden wurden, um eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des Tumors, wodurch das Risiko von Metastasen und Wiederauftreten der Krankheit4 zu zergliedern ,5.
Intra-Tumor Interaktionen und ihre möglichen Ergebnisse zu analysieren, neue 3D in-vitro- Ansätze wurden basierend auf den Einsatz von ECM-Extrakte, die eine sehr viel komplexere Mikroumgebung bieten näher an der Realität der Tumorbiologie, im Vergleich zu die konventionelle Monolage Zellkulturen, in denen die Zellen wachsen, befestigt an Kunststoff. Petersen und Bissell6 hat das erste Modell der Vorsteherdrüse und bösartige Mamma Epithelzellen kultiviert auf einer Basalmembran Laminin-reiche und waren die ersten, die 3D organotypischen Strukturen zu beschreiben, die Vorsteherdrüse Menschen diskriminieren Brust Epithelzellen von ihren bösartigen Pendants. Ein Jahrzehnt später, das Modell von Debnath, Muthuswamy, entwickelt und Brugge7,8,9 vorgesehen ein wertvolles Instrument um die biologischer Signalwege beeinträchtigt bei malignen Transformation von Drüsen Azini, erhellen diese als große Azini Formation durch Wildwuchs, Verlagerung der tight Junction-Proteine als Beweis für Sehbehinderte Zelle Polarisation und Verlust der Azini Lumen durch Zellresistenz, Anoikis, tritt ein programmierter Zelltod, die in Anchorage-abhängige Zellen, wenn sie von den umliegenden ECM zu lösen. Die Modelle der Sameni, Jedeszko und Sloane konzentrierten sich auf bildgebende proteolytische Aktivität von Zellen, die Invasivität, eine weitere wichtige Eigenschaft von Tumor Malignität10,11,12in engem Zusammenhang. Diese Modelle setzen auf Protein-Matrizen mit verschiedenen Fluoreszenz abgeschreckt Protein Substrate gemischt (DQ-Gelatine, DQ-Kollagen I und DQ-Kollagen IV), in welche fluoreszierende Signale sind bezeichnend für den proteolytischen Abbau von Kollagen. 3D-Modelle kann werden auch verwendet, um Stammzellen Eigenschaften beider nicht transformiert und Tumorzellen, in welcher Zelle Aggregate, auch genannt Sphäroide zu studieren, kultiviert in Suspension oder ECM-ähnliche Proteine für Mechanismen der Zelldifferenzierung, asymmetrische Verhören Zellteilung, Einhaltung von Zelle zu Zelle und Zelle Motilität13,14. Invasion-Assays ermöglichen testen die innere Aggressivität des Tumors und die Identifikation der Moleküle, die als Chemoattractants während der invasiven Verfahren15 dienen. Insgesamt, 3D Modelle repräsentieren eine erschwingliche Diversifikation in Vitro Zellkultur, die normal und onkogenen Gewebe Morphogenese genauer zu reflektieren.
Wir haben ein 3D Co Zellkultursystem basierend auf der oben genannten Modelle7,10,11, entworfen mit beiden menschliche kommerzielle BrC Zelllinien des bekannten aggressiven Potenzial (luminalen und Triple-negativen Typen) und primäre Zellen von BrC Patienten explantiert. Wir zuerst ein Modell entwickelt, wo waren entweder nicht-aggressive (MCF-7) oder aggressive (MDA-MB-231) BrC Zellen Co kultiviert mit U937 Monozyten im Auszug extrazelluläre Matrix (ECME)-basierten 3D System, das erlaubt direkten Zell-Zell-Interaktionen. Diese Ko-Kulturen wurden verwendet, um festzustellen, wie die Kommunikation zwischen diesen beiden Linien die Transkription einer Reihe von Genen im Zusammenhang mit Krebs aggressives Verhalten beeinflusst. Eine deutliche Steigerung der Cyclooxygenase-2 (COX-2) Abschrift wurde beobachtet, die fiel mit einer erhöhten Produktion von eines seiner Produkte, Prostaglandin E2 (PGE2), ein Befund, die die Rolle der Entzündung in der Tumorprogression hervorgehoben. Erhöhter Transkription von MMP wurde auch beobachtet, dass mit mehr Kollagen Proteolyse korreliert, wenn aggressive MDA-MB-231 Zellen zusammen mit U937 Monozyten in DQ-Kollagen IV-haltigen Kulturen gezüchtet wurden. Der Hinweis unterstützte unsere Ko-Kulturen nicht die Annahme, dass Zell-Zell-Interaktion-Mechanismen für den Abbau von Kollagen benötigt werden. Es schlug eher, dass die Kommunikation zwischen den beiden Linien durch sekretierten Moleküle vermittelt wurde. Darüber hinaus enthalten die Überstände geerntet aus dieser Kokultur Assays lösliche Faktoren, die Drüsen gebildet durch nicht-transformierten MCF-10A Zellen13Azini unorganisiert. Es wurde festgestellt, dass aggressive und primäre BrC Zellen abgesondert erhöhte Niveaus der Monocyte chemotaktische Moleküle MCP-1, GM-CSF und RANTES. So skizziert wir eine 3D Culture in der Zellen in Zelle Kultur Einsätze, Zell-Zell-Interaktionen zu verhindern getrennt wurden. Diese Kulturen wurden verwendet, um die indirekte Kommunikation zwischen BrC Zellen und Monozyten zu adressieren. Für diese Tests, nicht-aggressive und aggressive kommerzielle BrC-Zell-Linien und primären BrC Zellen und drei verschiedene Arten von menschlichen Monozyten: kommerzielle U937 und THP-1 Zellen und primäre Monozyten (PMs) aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern (alle isoliert Monozyten im nicht aktivierten Zustand verwendet wurden) wurden verwendet. Erhöhte Konzentrationen von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-8 wurden beobachtet, um in Kokultur angereichert werden. Ebenso wurde festgestellt, dass MMP-1, MMP-2 und MMP-10 auch in der BrC-Zellen-Monocyte-Ko-Kulturen und damit verstärkenden zurück Ergebnisse14erhöht wurden. In diesem Manuskript ist ein Punkt-für-Punkt-Workflow Erstisolierung BrC Zellen und Erprobung in 3D Kulturen zusammen mit repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Diese Arbeit ist ein gutes Beispiel für das große Potenzial, das in-vitro- 3D Zellsysteme bereitstellen, um spezifische Aspekte der Tumorbiologie zu befragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epithelzellen wachsen in eine 3D räumliche Konformation und deren Wechselwirkung mit den ECM-Proteinen ist von zentraler Bedeutung für die Gewebe-Homöostase. Viele Krebs-Studien basieren auf Zellen in Monolayer (2D) angebaut und obwohl sie für ein Verständnis von vielen Aspekten der Tumorbildung und Progression entscheidend gewesen sind, kann Monolagen nicht rekapitulieren die Merkmale, denen Zellen, für die ECM auferlegt Instanz: Begrenzung der Verbreitung, Haftung-abhängige Zelle überleben, apikalen basolateral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch CONACyT FONSEC SSA, IMSS/ISSSTE Projekt Nr. 233061, Ezequiel M. Fuentes-Pananá und Fondo de Apoyo a la Investigación, Krankenhaus Infantil de México Federico Gómez (Projektnummer HIM-2014-053) unterstützt. Espinoza-Sánchez NA ist Doktorand aus Programa de Doctorado de Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und erhielt der 231663 Stipendium CONACYT. E-S-NA, auch der finanzielle Unterstützung durch das mexikanische Institut der sozialen Sicherheit (IMSS) anerkennen.
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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