एक Extracellular मैट्रिक्स निकालने में Monocytes और प्राथमिक स्तन कैंसर कोशिकाओं के बीच संचार का विश्लेषण (ECME)-तीन आयामी प्रणाली आधारित
Summary
यहां, हम एक तीन आयामी संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए प्राथमिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का विश्लेषण, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अध्ययन करने के लिए अपने प्रत्यक्ष/monocytes के साथ अप्रत्यक्ष बातचीत और ऐसे कोलेजन क्षरण के रूप में परिणाम, प्रतिरक्षा सेल भर्ती, सेल आक्रमण, और कैंसर से संबंधित सूजन को बढ़ावा देने के ।
Abstract
extracellular मैट्रिक्स (ECM) में एंबेडेड, सामांय और नवोत्पादित उपकला कोशिकाओं को अच्छी तरह से टेम और गैर टेम कोशिकाओं के साथ संवाद, इस प्रकार बहुत सामांय ऊतक homeostasis और रोग के परिणाम को प्रभावित । स्तन कैंसर में ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) रोग प्रगति, मेटास्टेसिस, और पुनरावृत्ति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; इसलिए, ट्यूमर microenvironment और उनके ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए monocyte chemoattraction के तंत्र को समझने की बीमारी को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम मानव स्तन कैंसर (BrC) कोशिकाओं और मानव monocytes के एक तीन आयामी (3 डी) सह संस्कृति प्रणाली का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । BrC कोशिकाओं पर विनियमित के उच्च बेसल स्तर का उत्पादन-सक्रियण, सामांय टी सेल व्यक्त की है और secreted (rants), monocyte chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1), और granulocyte-macrophage कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जी सीएसएफ), जबकि सह में monocytes के साथ संस्कृति, प्रो भड़काऊ साइटोकिंस Interleukin (il)-1 बीटा (il-1β) और il-8 मैट्रिक्स metalloproteinases (एमएमपी)-1, एमएमपी-2, और एमएमपी-10 के साथ एक साथ समृद्ध थे । इस ट्यूमर स्ट्रोमा microenvironment MCF में anoikis के प्रतिरोध को बढ़ावा दिया-10A 3d acini-संरचनाओं की तरह, chemoattraction के monocytes, और आक्रामक BrC कोशिकाओं के आक्रमण । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक किफायती विकल्प के लिए इंट्रा ट्यूमर संचार का अध्ययन प्रदान करते है और महान क्षमता का एक उदाहरण है कि इन विट्रो में 3 डी सेल सिस्टम ट्यूमर ट्यूमर से संबंधित जीव विज्ञान की विशिष्ट सुविधाओं से पूछताछ करने के लिए प्रदान आक्रामकता.
Introduction
ट्यूमर जीव विज्ञान पहले से सोचा से कहीं अधिक जटिल है । बढ़ते सबूत से पता चलता है कि ट्यूमर कोशिकाओं अनियंत्रित proliferating कोशिकाओं के एक मात्र थोक से अधिक कर रहे हैं; बल्कि, विभिंन नवोत्पादित कोशिकाओं को विभिंन ट्यूमर1के भीतर उच्च संगठन और पदानुक्रम प्रदर्शित करने के कार्यों प्रदर्शन करने लगते हैं । ट्यूमर कोशिकाओं को भी गैर-रूपांतरित कोशिकाओं के साथ अंतरंग संचार में कर रहे हैं: मैक्रोफेज, fibroblasts, लिम्फोसाइटों, adipocytes, endothelial कोशिकाओं, अन्य कोशिकाओं के बीच सब पाड़ प्रोटीन और polysaccharides कि ECM गठन में डूबे हुए हैं । कई प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष बातचीत रूपांतरित और गैर-रूपांतरित कोशिकाओं और ECM, जो रोग के परिणाम2,3पर एक शक्तिशाली प्रभाव डालती है के बीच स्थापित कर रहे हैं । BrC के विशिष्ट मामले में, यह विशेष रूप से TAMs के साथ BrC कोशिकाओं के संचार टुकड़े महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि TAMs ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा पाया गया है, मेटास्टेसिस के जोखिम में वृद्धि और रोग पुनरावृत्ति4 ,5.
अंतर-ट्यूमर बातचीत और उनके संभावित परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, नए 3 डी इन विट्रो दृष्टिकोण ECM निष्कर्षों के उपयोग के आधार पर विकसित किया गया है कि एक बहुत अधिक जटिल microenvironment प्रदान, ट्यूमर जीव विज्ञान की वास्तविकता के करीब, की तुलना में पारंपरिक monolayer कोशिका संस्कृतियों जिसमें कोशिकाओं प्लास्टिक से जुड़ी हो जाना । पीटरसन और बिसेल6 घातक और घातक स्तन उपकला एक laminin-अमीर तहखाने झिल्ली पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के पहले मॉडल प्रदान की और 3 डी organotypic संरचनाओं कि भेदभाव घातक मानव का वर्णन करने के लिए पहले थे उनके घातक समकक्षों से स्तन उपकला कोशिकाओं. एक दशक बाद, Debnath द्वारा विकसित मॉडल, Muthuswamy, और Brugge7,8,9 ग्रंथियों acini के घातक परिवर्तन के दौरान समझौता जैविक रास्ते स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान की, ऐसे अनियंत्रित प्रसार के कारण बड़े acini गठन के रूप में, बिगड़ा सेल ध्रुवीकरण के सबूत के रूप में तंग जंक्शन प्रोटीन के स्थानीयकरण, और anoikis के लिए सेल प्रतिरोध का एक परिणाम के रूप में acini लुमेन के नुकसान, क्रमादेशित सेल मौत का एक प्रकार है कि में होता है anchorage-निर्भर कोशिकाओं को जब वे आसपास के ECM से अलग । Sameni, Jedeszko, और Sloane के मॉडल कोशिकाओं द्वारा इमेजिंग proteolytic गतिविधि पर ध्यान केंद्रित किया है, जो बारीकी से इनवेसिव करने के लिए संबंधित है, ट्यूमर द्रोह के एक अन्य महत्वपूर्ण लक्षण10,11,12. इन मॉडलों पर निर्भर प्रोटीन अलग प्रतिदीप्ति के साथ मिश्रित मैट्रिक्स-बुझती प्रोटीन सब्सट्रेट (डीक्यू-जिलेटिन, डीक्यू-कोलेजन मैं, और डीक्यू-कोलेजन IV), जिसमें फ्लोरोसेंट संकेतों कोलेजन का proteolytic गिरावट का संकेत कर रहे हैं । 3 डी मॉडल भी दोनों गैर रूपांतरित और ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेम सेल गुणों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें सेल समुच्चय, भी spheroids पद, निलंबन में या ECM में कल्चरित किया जा सकता है-जैसे प्रोटीन सेल भेदभाव के तंत्र के लिए पूछताछ, असममित सेल प्रभाग, सेल-टू-सेल पालन, और सेल गतिशीलता13,14. आक्रमण परख ट्यूमर के आंतरिक आक्रामकता और अणुओं है कि इनवेसिव प्रक्रिया15के दौरान chemoattractants के रूप में सेवा की पहचान के परीक्षण की अनुमति । कुल मिलाकर, 3d मॉडल इन विट्रो सेल संस्कृति के एक किफायती विविधीकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं जो और अधिक बारीकी से सामान्य और oncogenic ऊतक morphogenesis को प्रतिबिंबित करते हैं ।
हम एक 3 डी सेल सह संस्कृति प्रणाली aforementioned मॉडल7,10,11के आधार पर बनाया गया है, ज्ञात आक्रामक क्षमता के दोनों मानव वाणिज्यिक BrC सेल लाइनों का उपयोग (चमकदार और ट्रिपल-नकारात्मक प्रकार) और प्राथमिक कोशिकाएँ BrC रोगियों से explanted हैं. हम पहले जहां या तो गैर आक्रामक (MCF-7) या आक्रामक (एमडीए-एमबी-२३१) BrC कोशिकाओं सह एक extracellular मैट्रिक्स निकालने में U937 monocytes के साथ संस्कृति थे विकसित (ECME)-आधारित 3 डी प्रणाली है कि सीधे सेल सेल बातचीत की अनुमति दी । इन सह संस्कृतियों का निर्धारण कैसे इन दो कोशिका वंश के बीच संचार कैंसर आक्रामक व्यवहार से संबंधित जीन का एक सेट की प्रतिलिपि को प्रभावित किया गया । साइक्लोऑक्सीजिनेज-2 की एक महत्वपूर्ण वृद्धि (कॉक्स-2) प्रतिलिपि देखा गया था कि अपने उत्पादों में से एक की वृद्धि हुई उत्पादन के साथ मेल, प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2), एक खोज है कि कैंसर प्रगति में सूजन की भूमिका पर प्रकाश डाला । एमएमपी की वृद्धि की प्रतिलेखन भी देखा गया था कि अधिक से अधिक कोलेजन प्रोटियोलिसिस के साथ संबंधित जब आक्रामक एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं सह थे डीक्यू में U937 monocytes-कोलेजन IV संस्कृतियों युक्त के साथ संस्कृति । नोट की, हमारे सह संस्कृतियों धारणा है कि सेल सेल संपर्क तंत्र कोलेजन क्षरण के लिए आवश्यक है का समर्थन नहीं किया । यह नहीं बल्कि सुझाव दिया है कि दो कोशिका वंश के बीच संचार गुप्त अणुओं द्वारा मध्यस्थता की थी । इसके अलावा, इन सह संस्कृति परख से काटा supernatants घुलनशील कारकों निहित है कि ग्रंथियों गैर द्वारा गठित acini-बदल MCF-10A कोशिकाओं को13। यह पाया गया कि आक्रामक और प्राथमिक BrC कोशिकाओं monocyte chemotactic अणुओं एमसीपी-1, जीएम-सीएसएफ, और rants के ऊंचा स्तर स्रावित । इस प्रकार, हम कक्ष-कक्ष सहभागिता को रोकने के लिए कक्ष संस्कृति आवेषण में कक्षों को अलग किया गया था, जिसमें एक 3d संस्कृति रेखांकित । इन संस्कृतियों BrC कोशिकाओं और monocytes के बीच अप्रत्यक्ष संचार का पता करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इन परख के लिए, गैर आक्रामक और आक्रामक वाणिज्यिक BrC सेल लाइनों और प्राथमिक BrC कोशिकाओं, और मानव monocytes के तीन विभिंन प्रकार: वाणिज्यिक U937 और THP-1 कोशिकाओं, और प्राथमिक monocytes (पीएमएस) स्वस्थ दाताओं के परिधीय रक्त से पृथक (सभी monocytes एक गैर सक्रिय राज्य में इस्तेमाल किया गया) इस्तेमाल किया गया । भड़काऊ साइटोकिंस il-1β और il-8 की वृद्धि की सांद्रता सह संस्कृति में समृद्ध किया जा करने के लिए मनाया गया । इसी प्रकार, यह पाया गया कि एमएमपी-1, एमएमपी-2, और एमएमपी-10 भी BrC कोशिकाओं में वृद्धि हुई-monocyte सह संस्कृतियों, और इस तरह पिछले निष्कर्षों को मजबूत14. इस पांडुलिपि में, प्राथमिक BrC कोशिकाओं के अलगाव और 3 डी संस्कृतियों में परीक्षण के एक बिंदु-दर-बिंदु कार्यप्रवाह प्रतिनिधि परिणामों के साथ प्रस्तुत किया है । इस काम में महान क्षमता का एक अच्छा उदाहरण है कि इन विट्रो 3 डी सेल सिस्टम ट्यूमर जीव विज्ञान के विशिष्ट पहलुओं से पूछताछ करने के लिए प्रदान का गठन किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपकला कोशिकाओं को एक 3 डी स्थानिक अनुरूपता में बढ़ने और ECM प्रोटीन के साथ उनकी बातचीत ऊतक homeostasis के लिए निर्णायक है. कई कैंसर के अध्ययन monolayers में उगाई कोशिकाओं के आधार पर किया गया है (2d) और यद्यपि वे ट्यूमर गठन औ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE परियोजना सं २३३०६१ से Ezequiel M. Fuentes-Pananá और Fondo de Apoyo एक ला Investigación, अस्पताल Infantil de México Federico Gómez (परियोजना संख्या उसे-2014-053) द्वारा समर्थित किया गया था । Espinoza-Sánchez ना Programa डे Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (उणां) से डॉक्टरेट की छात्रा है और CONACYT से फैलोशिप २३१६६३ प्राप्त की । ई एस ना, यह भी वित्तीय मैक्सिकन सामाजिक सुरक्षा संस्थान (IMSS) द्वारा प्रदान की सहायता स्वीकार करते हैं ।
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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