Analysera kommunikationen mellan monocyter och primär bröstcancerceller i en extracellulär Matrix extrakt (ECME)-baserat tredimensionella System
Summary
Här, beskriver vi en tredimensionell kultur metod för att analysera morfologi av primär bröstcancerceller, samt att studera deras indirekt interaktion med monocyter och utfall såsom kollagen nedbrytning, immunceller rekrytering, cell invasionen, och främjande av cancer-relaterade inflammation.
Abstract
Inbäddad i den extracellulära matrixen (ECM), kommunicera normal och neoplastiska epitelial celler intimt med hematopoetiska och icke-hematopoetiska celler, således kraftigt påverka normal vävnad homeostas och sjukdom resultatet. I bröstcancer spelar tumör-associerad makrofager (TAMs) en avgörande roll i sjukdomsprogression, metastaser och upprepning, förstå mekanismerna av monocyt kemoattraktion till den tumör närmiljön och deras interaktioner med tumörceller därför viktigt att kontrollera sjukdomen. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ett tredimensionellt (3D) samtidig kultur mänskliga bröstcancer cancerceller (BrC) och humana monocyter. BrC celler producerade höga basala nivåer av reglerade på-aktivering, normala T-celler uttrycks och utsöndras (RANTES), monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1 och andra) och granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), medan i samtidig kultur med monocyter, Pro-inflammatoriska cytokiner Interleukin (IL) -1 beta (IL-1β) och IL-8 berikades tillsammans med matrix metalloproteinaser (MMP) -1, MMP-2 och MMP-10. Denna tumör stroma mikromiljö främjas motstånd mot anoikis i MCF-10A 3D acini-liknande strukturer, kemoattraktion av monocyter, och invasionen av aggressiva BrC celler. De protokoll som presenteras här ger ett prisvärt alternativ för att studera intra-tumör kommunikation och är ett exempel på den stora potential som in vitro- 3D cellsystem tillhandahåller för att förhöra särdragen i tumörbiologi relaterade till tumör aggression.
Introduction
Tumörbiologi är långt mer komplicerad än man tidigare trott. Montering av bevis visar att tumörceller är mer än bara en bulk av okontrollerad prolifererande celler; snarare verkar olika neoplastiska celler utför olika funktioner som visar hög organisation och hierarki inom tumör1. Tumörceller är också i intim kommunikation med icke-omvandlad celler: fibroblaster, adipocyter, lymfocyter, makrofager, endotelceller, bland andra celler är alla nedsänkt i byggnadsställning proteiner och polysackarider som utgör ECM. Många direkta och indirekta interaktioner är etablerade mellan cellerna omvandlas och icke-omvandlad och med ECM, som utövar ett kraftfullt inflytande över sjukdom resultatet2,3. I det specifika fallet med BrC är det särskilt viktigt att dissekera meddelandet av BrC celler med TAMs, med tanke på att TAMs har visat sig spela en avgörande roll i utvecklingen av tumören, ökar risken för metastasering och sjukdomen återkommer4 ,5.
För att analysera intra-tumoral interaktioner och deras möjliga utfall, nya 3D in vitro- metoder har utvecklats baserat på användning av ECM-extrakt som ger en mycket mer komplex mikromiljö, närmare verkligheten i tumörbiologi, i jämförelse med konventionella enskiktslager cellkulturer där cellerna växa bifogas plast. Petersen och Bissell6 första modellerar av godartad och elakartad bröst epitelceller odlade på en laminin-rika basalmembranet och var de första att beskriva den 3D organotypic strukturer som diskriminerar godartad mänskliga bröst epitelceller från maligna motsvarigheterna. Ett decennium senare, modellen utvecklades av har, Timmy, och Brugge7,8,9 som ett värdefullt verktyg för att belysa de biologiska spridningsvägar äventyras under elakartad omformning av glandular acini, sådana som stora acini bildande på grund av okontrollerad spridning, omlokaliseringar av åtsittande föreningspunkt proteiner som bevis på försämrad cell polarisering, och förlust av acini lumen till följd av cell resistens mot anoikis, en typ av programmerad celldöd som uppstår i Anchorage-beroende celler när de lossnar från omgivande ECM. Modeller av Sameni, Jedeszko och Sloane har fokuserat på imaging proteolytiska aktivitet av celler, som är nära besläktade invasivitet, ett annat avgörande drag av tumör malignitet10,11,12. Dessa modeller förlitar sig på protein matriser blandat med olika fluorescens-kylda protein substrat (DQ-gelatin, DQ-kollagen I, och DQ-kollagen IV), i vilken fluorescerande signaler är vägledande för den proteolytisk nedbrytningen av kollagen. 3D-modeller används också för att studera stamceller egenskaper av både icke-omvandlad och tumörceller, i vilken cell aggregat, även benämnda spheroids, kan vara odlade i suspension eller ECM-liknande proteiner förhör för mekanismer för celldifferentiering, asymmetrisk celldelning, efterlevnad av cell-till-cell och cell motilitet13,14. Invasionen-analyser möjliggör testning av den inneboende aggressiviteten av tumören och identifiering av de molekyler som fungerar som chemoattractants under de invasiva process15. Övergripande, 3D modeller representerar en prisvärd diversifiering av in vitro- cellkultur som nära återspeglar normal och onkogena vävnad morfogenes.
Vi har utformat en 3D samtidig cellodlingssystem baserat på ovan nämnda modeller7,10,11, använder både mänskliga kommersiella BrC cellinjer av känd aggressiva potential (luminala och triple-negativa typer) och primär celler explanterad från BrC patienter. Vi först utvecklades en modell där antingen icke-aggressiv (MCF-7) eller aggressiv (MDA-MB-231) BrC celler var samtidig odlade med U937 monocyter i ett extracellulärmatrix extrakt (ECME)-baserat 3D-system som får direkta cell-cell interaktioner. Dessa samtidig kulturer användes för att bestämma hur kommunikationen mellan dessa två cell härstamningar påverkat transkriptionen av en uppsättning gener besläktade med cancer aggressivt beteende. En betydande ökning av cyklooxygenas-2 (COX-2) Avskrift observerades som sammanföll med en ökad produktion av en av dess produkter, prostaglandin E2 (PGE2), ett konstaterande som markerat rollen av inflammation i cancer progression. Ökad transkription av MMP sågs också som korrelerade med större kollagen proteolys när aggressiva MDA-MB-231 celler odlades Co med U937 monocyter i DQ-kollagen IV-innehållande kulturer. Notera stödde våra samtidig kulturer inte antagandet att cell-cell interaktioner mekanismer behövs för kollagen nedbrytning. Det föreslog snarare att kommunikationen mellan de två cell linjerna var medieras av utsöndrade molekyler. Dessutom innehöll supernatanterna skördas från dessa samtidig kultur analyser lösliga faktorer som oorganiserad glandular acini bildas av icke-omvandlad MCF-10A celler13. Det konstaterades att aggressiva och primära BrC celler utsöndras förhöjda nivåer av monocyt kemotaktisk molekyler MCP-1, GM-CSF och RANTES. Således skisserat vi en 3D kultur där skildes celler i cell kultur skär att förhindra cell-cell interaktioner. Dessa kulturer användes för att ta itu med indirekta kommunikationen mellan BrC celler och monocyter. För dessa analyser, icke-aggressiv och aggressiva kommersiella BrC cellinjer och primära BrC celler och tre olika typer av humana monocyter: kommersiella U937 och THP-1 celler och primära monocyter (PMs) isolerade perifert blod från friska donatorer (alla monocyter användes i ett icke-aktiverade tillstånd) användes. Ökade koncentrationer av inflammatoriska cytokiner IL-1β och IL-8 observerades för att berikas i samtidig kultur. Dessutom konstaterades det att MMP-1, MMP-2 och MMP-10 var också ökat i BrC celler-monocyt samtidig kulturer och därmed stärka tidigare fynd14. I detta manuskript presenteras en punkt för punkt arbetsflödet av primära BrC celler isolering och provning i 3D kulturer tillsammans med representativa resultat. Detta arbete utgör ett bra exempel på den stora potential som in vitro- 3D cellsystem tillhandahåller för att förhöra specifika aspekter av tumörbiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitelceller växer i en 3D rumsliga konformation och deras interaktion med ECM proteiner är avgörande för vävnad homeostas. Många cancer studier baserats på celler odlade i enskiktslager (2D) och även om de har varit avgörande för att förstå många aspekter av tumörbildning och progression, enskiktslager recapitulate inte egenskaper som ECM ålägger celler, för instans: begränsa spridning, vidhäftning-beroende cellöverlevnad, apikala-basolateral polaritet, ECM remodeling, celldifferentiering, m.m.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds av CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE projekt nr 233061 till Ezequiel M. Fuentes-Pananá och Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (projektnummer HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA är doktorand från Programa de Doctorado sv Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) och mottagna gemenskap 231663 från CONACYT. E-S NA, bekräftar också det finansiella stöd som tillhandahålls av mexikanska Institutet för Social trygghet (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
