粘附细胞培养的时间推移荧光显微镜对蛋白质降解率的单细胞定量研究
Summary
该协议描述了一种方法, 以确定蛋白质半生命的单一生活粘附细胞, 使用脉冲标记和荧光时间推移成像的捕捉标签融合蛋白。
Abstract
蛋白质处于合成和降解的动态状态, 它们的半衰期可以在各种情况下进行调节。然而, 最常用的测定蛋白质半衰期的方法要么仅限于裂解细胞的总体平均值, 要么需要使用蛋白质合成抑制剂。该协议描述了一种方法来测量蛋白质半衰期在单一的生活粘附细胞, 使用捕捉标签融合蛋白结合荧光时间推移显微镜。任何有兴趣的蛋白质都可以通过与 benzylguanine 衍生物结合的荧光、细胞渗透染料与一个标签的共价键结合, 并且在残留染料被冲蚀后可以对标记蛋白的衰变进行监测。随着时间的推移, 细胞的跟踪和综合荧光强度的量化导致了每个跟踪细胞的指数衰减曲线, 从而可以通过曲线拟合确定单个细胞的蛋白质降解率。这种方法为培养细胞中半生命体的异质性提供了一个估计, 这是不能用其他方法来评估的。这里提出的方法适用于任何类型的培养粘附细胞表达的兴趣蛋白融合到一个 SNAP 标签。在这里, 我们使用小鼠胚胎干细胞生长在 e-钙黏附素涂层细胞培养板, 以说明如何单细胞降解率的蛋白质与广泛的半衰期可以确定。
Introduction
众所周知, 细胞蛋白具有广泛的周转, 合成和降解率是特定的每个蛋白质和受生理调节。传统上, 蛋白质降解率已被测量使用散装方法, 如放射性脉冲追逐分析, 或涉及蛋白质合成抑制剂, 如放线菌1。最近, 与质谱联用的细胞培养 (SILAC) 中的氨基酸的稳定同位素标记已经建立, 以在全球范围内量化蛋白质周转量2。但是, 这些方法受人口平均的限制, 因此, 关于细胞间可变性的信息就会丢失。此外, 无法确定在整个细胞中不同步的蛋白质降解的瞬态变化。
另外, 蛋白质半衰期也可以通过荧光的方法来确定, 这通常具有提供单细胞分辨率的优点。例如, 一个 photoactivatable 的绿色荧光蛋白 (paGFP) 已经被用来确定早期哺乳动物胚胎中的 Oct4 半衰期3。另一种监测活细胞中蛋白质衰变的方法是使用捕捉标记与荧光延时成像相结合。SNAP 标签是一个变种版本的 dna 修复酶 O6-alkylguanine dna-alkyltransferase (AGT), 特别是与 benzylguanine (BG) 衍生物, 这可以耦合到分子探针4,5,6. 因此, 任何捕捉标签的融合蛋白都可以用荧光、细胞渗透染料进行不可逆转的标记。脉冲标记的兴趣蛋白融合到 SNAP 标签, 其次是残留染料的冲洗, 允许监测的标记蛋白的人口的退化, 从而确定蛋白质半生命。SNAP 标签已成功地用于蛋白质的脉冲追逐标记和确定蛋白半生命的黏附细胞培养和在体内5,7,8,9。在商业上有大量的对齐标签衬底覆盖常用的荧光光谱, 使每个特定应用的最佳染料的选择。因此, SNAP 标签也可以用于多色成像结合其他荧光融合蛋白或染料。细胞不渗透性染料适用于膜栓蛋白的标记, 而细胞通透性染料则适用于细胞内和膜结合蛋白的监测。此外, 这些探针中的一些几乎没有基本的荧光, 只有在绑定到 SNAP 标记10时才开始发出强烈的荧光信号。
本协议描述了如何使用 SNAP 标签测量单个细胞中不同蛋白质的降解率。我们将这种方法应用于小鼠胚胎干细胞培养的 e-钙黏蛋白, 但它应该有可能使用它与任何黏附培养的细胞类型。我们表明, 脉冲标记的快照标签融合蛋白, 其次是荧光时间推移成像, 允许确定的单个细胞半衰期的各种蛋白质的兴趣, 并提供了一个估计的细胞变化的一半生命在培养细胞的数量。
Protocol
Representative Results
Discussion
当使用 SNAP 标签来监测蛋白质衰变时, 最关键的一步是确保在培养基中或在洗涤后的细胞中没有残留的未粘合染料, 否则它可能在实验过程中与新产生的 SNAP 标签分子结合在一起。伊破坏衰变曲线。这是一方面通过仔细执行所有描述的洗涤步骤实现的。另一方面, 染料的浓度应该保持尽可能低, 而仍然在一个范围, 允许获得一个良好的信噪比。如图 2所示, 应通过测试不同的稀?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在生物分子筛查设施 (BSF), 洛桑进行了时间推移显微镜实验。我们感谢马克 Delachaux (服务 Audiovisuel, 洛桑) 的录像和编辑的电影。
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
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