Summary

Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Published: February 04, 2018
doi:

Summary

Este protocolo descreve um método para determinar a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando pulso rotulagem e imagem latente de lapso de tempo de fluorescência de proteínas da fusão SNAP-marca.

Abstract

As proteínas estão em um estado dinâmico da síntese e degradação e sua meia-vida podem ser ajustada sob várias circunstâncias. No entanto, mais comumente usados abordagens para determinar ou Half-Life da proteína são limitados para as médias de população de células lisadas ou exigem o uso de inibidores da síntese de proteínas. Este protocolo descreve um método para medir a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando proteínas da fusão SNAP-etiqueta em combinação com microscopia de fluorescência lapso de tempo. Qualquer proteína de interesse fundido a um SNAP-tag pode ser ligados covalentemente por uma tintura fluorescente, de célula permeável que está acoplada a um derivado de benzylguanine, e a decadência da população rotulada de proteína pode ser monitorizada após a lavagem do corante residual. Célula subsequente acompanhamento e quantificação da intensidade da fluorescência integrado sobre resultados de tempo em uma curva de decaimento exponencial para cada célula rastreada, permitindo a determinação de taxas de degradação de proteínas em células únicas pelo encaixe de curva. Este método fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas, que não podem ser facilmente avaliados por outros métodos. A abordagem apresentada aqui é aplicável a qualquer tipo de culturas de células aderentes de expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag. Aqui usamos as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas em placas de cultura de células E-caderina-revestido para ilustrar como único degradação celular, taxas de proteínas com uma ampla gama de meia-vida podem ser determinadas.

Introduction

É sabido que as proteínas celulares passam por extenso volume de negócios, com taxas de síntese e degradação, sendo específicas para cada proteína e sujeitas a regulação fisiológica. Tradicionalmente, taxas de degradação de proteínas são medidos usando métodos em massa, tais como análise de perseguição de pulso radioactivos, ou envolvendo inibidores da síntese de proteínas tais como cicloheximida1. Mais recentemente, isótopo estável, etiquetando com aminoácidos na cultura de pilha (SILAC) em combinação com a espectrometria de massa foi estabelecido para quantificar o volume de negócios de proteína em uma escala global2. No entanto, esses métodos são limitados por uma média de população, e informações sobre a variabilidade de célula para célula, portanto, estão perdidas. Além disso, mudanças transientes na degradação de proteínas que são sincronizadas através de população celular não podem ser identificadas.

Alternativamente, proteína de meia-vida também pode ser determinado por abordagens baseadas em fluorescência, que muitas vezes têm a vantagem de fornecer resolução de célula única. Por exemplo, uma proteína fluorescente verde photoactivatable (paGFP) tem sido usada para determinar o Oct4 Half-Life no início3embriões de mamíferos. Um outro método para monitorar a degradação de proteínas em células vivas é o uso de uma marca de SNAP em combinação com a imagem de lapso de tempo de fluorescência. A SNAP-tag é uma versão mutante da enzima O reparo DNA6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) que reage especificamente com benzylguanine derivados de (BG), que podem ser acoplados ao sondas moleculares4,5, 6. portanto, qualquer proteína de fusão SNAP-etiqueta pode ser irreversivelmente rotulada com um corante fluorescente, de permeável célula. Rotulagem de pulso de uma proteína de interesse fundido a marca do SNAP, seguida de esmaecimento do corante residual, permite para monitorar a degradação da população rotulada de proteína e, portanto, para a determinação de Half-Life da proteína. SNAP-etiquetas tem sido utilizados com sucesso para a rotulagem de pulso-perseguição de proteínas e para a determinação da proteína meias-vidas em aderente celulares cultura e na vivo5,7,8,9. Uma grande variedade de substratos SNAP-marca cobrindo comumente usado de espectros fluorescentes são comercialmente disponíveis, permitindo a seleção do corante ideal para cada aplicação específica. Assim, SNAP-marcas também podem ser usadas para a imagem latente multicolor em combinação com outras proteínas da fusão fluorescente ou corantes. Corantes célula-impermeável são adequados para a rotulagem das proteínas de membrana-amarrados, Considerando que a célula-permeável corantes são aplicáveis para o monitoramento de proteínas intracelulares e membrana-limite. Além disso, alguns dos tais sondas não exibem quase nenhuma fluorescência basal e apenas começam a emitir um sinal fluorescente forte sobre vinculação a um SNAP-marca10.

Este protocolo descreve como medir as taxas de degradação de proteínas diferentes de interesse em células únicas usando um SNAP-tag. Aqui podemos aplicar esse método para as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas na E-caderina, mas deve ser possível usá-lo com qualquer tipo de células cultivadas aderentes. Mostramos que pulso rotulagem de proteínas da fusão SNAP-marca seguidas por imagens de lapso de tempo de fluorescência permite determinar as única célula meias-vidas de várias proteínas de interesse e fornece uma estimativa para a variabilidade de célula para célula de meias-vidas em um população de células cultivadas.

Protocol

Nota: Neste estudo, foi usada a linha da célula E14 ES. No entanto, este protocolo é directamente aplicável a qualquer outra linha de células de rato ES expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag, marcando a proteína endógena ou usando superexpressão. Para os exemplos mostrados na seção de resultados, foram utilizadas linhas de células de fusão SNAP-tag doxiciclina-inducible (SNAP-marca fundiu-se para as seguintes proteínas: Nanog, Oct4, Srsf11, ou para o mOrange2 de proteínas fluorescentes e…

Representative Results

O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade de célula para célula em Half-Life para qualquer proteína dada fundida a um SNAP-tag. O uso de recombinante E-caderina-Fc para o revestimento da placa de imagem permite a resolução única célula em células de ES, que, de outra forma, crescem nas colônias. Células individuais podem ser controladas separadamente ao longo do filme ( figura 1A). Para determinar a meia-vida de proteína para cada cé…

Discussion

A etapa mais crucial quando usando um SNAP-tag para monitorar a deterioração de proteína é garantir que nenhuma tintura desacoplada residual é deixada no meio ou nas células após a lavagem, caso contrário pode vincular recém produzido moléculas SNAP-marca mais tarde durante o experimento e ther Eby comprometer a curva de decaimento. Isto é por um lado, alcançado realizando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração de corante deve ser mantida tão baixa quanto possí…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

No Biomolecular triagem Facility (BSF), EPFL, foram realizados experimentos de microscopia de lapso de tempo. Agradecemos a Marc Delachaux (serviço audiovisual, EPFL) para a produção de vídeo e edição do filme.

Materials

Equipment
ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 353003
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate Corning 353219
Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm Marienfeld-superior 640030
CO2 Incubator Panasonic MCO-170AICUV-PE
Centrifuge 5804 R Eppendorf 5804000528
InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System GE Healthcare Life Sciences 29027886
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Glasgow Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich G5154
Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified ThermoFisher 16141-079
Sodium pyruvate solution Sigma-Aldrich 113-24-6
Minimum Essential Medium  Non-Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-035
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00H
L-Glutamine 200mM ThermoFisher 25030-024
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689-25ML-F
Leukemia Inhibitory factor Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. 
CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) Merck Millipore 361559
PD 0325901 Sigma-Aldrich 391210-10-9
Gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Dulbecco's PBS 10x concentrated BioConcept 3-05K00-I
Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ BioConcept 3-05F29-I
Trypsin-EDTA-Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049
Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein R&D systems 748-EC-050
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
SNAP-Cell 647-SiR New England BioLabs S9102S
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A18967-01
Name Company Catalog Number Comments
Software
FIJI Open-source image analysis software
MATLAB R2014a Mathworks
Microsoft Excel Microsoft

References

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Cite This Article
Alber, A. B., Suter, D. M. Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56604, doi:10.3791/56604 (2018).

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