תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז’ן SNAP-תג.
Abstract
חלבונים הם במצב דינמי של סינתזה, השפלה, החצי חייהם יכול להיות מותאם תחת נסיבות שונות. עם זאת, הנפוץ ביותר גישות לקביעת חלבון מחצית חיים האם מישהו מוגבל ממוצעים באוכלוסייה מתאי lysed או מחייבות שימוש מעכבי סינתזת חלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדוד חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות SNAP-תג פיוז’ן חלבונים בשילוב עם מיקרוסקופ זמן לשגות זריחה. כל חלבון עניין דבוקה תג SNAP יכולות להיות covalently קשורות על ידי תא פלורסנט, חדיר לצבוע את זה משולב נגזרת benzylguanine, ניתן לנטר את הדעיכה של האוכלוסייה חלבון שכותרתו לאחר שטיפה של לצבוע שיורית. תא עוקבות מעקב, כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב מעל הזמן יוצרת מעגל דעיכה מעריכית עבור כל תא מסומנים, מתן אפשרות לקביעת חלבון השפלה בבתי תאים בודדים על ידי עקומת התאמה. שיטה זו מספקת הערכה הטרוגניות של מחצית החיים בקרב אוכלוסיה של תאים בתרבית, אשר לא יכול בקלות להיות מוערך על ידי שיטות אחרות. הגישה המוצגת כאן היא ישימה לכל סוג של בתרבית תאים חסיד ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP. כאן אנו משתמשים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר גדל על צלחות תרבות תא E קדהרין-מצופים להמחשת השפלה תא יחיד איך המחירים של חלבונים עם מגוון רחב של מחצית החיים יכול להיקבע.
Introduction
זה ידוע כי החלבונים עוברים תחלופת נרחב, עם המחירים סינתזה והשפלה להיות ספציפיים עבור כל חלבון ובכפוף תקנה פיזיולוגיים. באופן מסורתי, חלבון השפלה המחירים כבר נמדד בשיטות בתפזורת, כגון ניתוח צ’ייס הדופק רדיואקטיביים, או מעורבים מעכבי סינתזה חלבונים כגון cycloheximide1. לאחרונה, איזוטופ יציב תיוג עם חומצות אמינו בתרבות תא (SILAC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה הוקם לכמת חלבון מחזור על מידה עולמי2. עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי ממוצע של אוכלוסייה, מידע על השתנות לתא ולכן הוא אבוד. יתר על כן, אין אפשרות לזהות שינויים חולף ב השפלה חלבון זה הם מסונכרן על פני האוכלוסייה תא.
לחלופין, חלבון מחצית החיים יכול להיקבע גם על-ידי קרינה פלואורסצנטית גישות, אשר לעיתים קרובות יש את היתרון של מתן רזולוציה תא בודד. למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק photoactivatable (paGFP) שימש כדי לקבוע Oct4 half-life של יונקים העובר מוקדם3. שיטה נוספת לעקוב אחר דעיכה חלבונים בתאים חיים היא השימוש תג הצמד בשילוב עם פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ. SNAP-התג הוא גרסה מוטציה של ה-DNA תיקון אנזים O6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (של AGT) זה במיוחד מגיב עם benzylguanine (BG) נגזרים, אשר יכול להיות מצמידים הגששים מולקולרית4,5, 6. לכן, כל חלבון כימרי SNAP-תג יכול להיות בלתי הפיך עם תוויות צבע חדיר פלורסנט, תא. הדופק תיוג של חלבון עניין התמזגו SNAP-תג, ולאחריה שטיפה של לצבוע שיורית, מאפשר לניטור ההשפלה של האוכלוסייה שכותרתו חלבון ובכך לקביעת חלבון half-life. SNAP-tags שימשו בהצלחה במשך. צ’ייס הדופק תיוג של חלבונים, לקביעת חלבון מחצית החיים ב מחסידי תא תרבות, אין ויוו5,7,8,9. ספקטרה פלורסנט מגוון גדול של מצעים SNAP-תג כיסוי נפוץ זמינים מסחרית, המאפשרת הבחירה של לצבוע האופטימלי עבור כל יישום ספציפי. לפיכך, SNAP-tags יכול לשמש גם עבור הדמיה ססגוניות בשילוב עם חלבונים פיוז’ן פלורסנט או צבעים אחרים. תא אטום צבעי מתאימים עבור תיוג קשורה קרום חלבונים, ואילו צבעי תא חדיר הינם ישימים עבור ניטור חלבונים תאיים והן קרום מאוגד. יתר על כן, חלק רגשים אלו שהפגינו כמעט אין קרינה פלואורסצנטית הבזליים, רק להתחיל לשדר אות ניאון חזק על קשירה SNAP-תג10.
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד את שיעורי השפלה של חלבונים שונים עניין בתאים בודדים באמצעות תג SNAP. כאן אנו מיישמים שיטה זו לתאי גזע עובריים (ES) העכבר בתרבית על E-קדהרין, אבל זה צריך להיות ניתן להשתמש בה עם כל סוג תאים בתרבית חסיד. אנחנו מראים כי הדופק תיוג של חלבונים פיוז’ן SNAP-תג ואחריו קרינה פלואורסצנטית הדמיה בצילום מואץ מאפשר לקביעת תא בודד מחצית החיים של חלבונים שונים של עניין, ומספק הערכה ההשתנות לתא של מחצית החיים ב אוכלוסיית תאים בתרבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב המכריע ביותר כאשר היא בעזרת תג SNAP לפקח חלבון דעיכה כדי להבטיח כי אין צבע לא מאוגד שיורית שנשאר במדיום או בתאים אחרי כביסה, אחרת זה עלול להיקשר החדש מיוצר מולקולות SNAP-תג מאוחר יותר במהלך ניסוי של שם פשרה eby העקומה דעיכה. זה מצד אחד, מושגת על ידי ביצוע בקפידה את כל השלבים המתוארים כביסה. מצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיקרוסקופ זמן לשגות הניסויים בוצעו ב למערכות ביולוגיות הקרנת מתקן (BSF), EPFL. אנו מודים מארק Delachaux (שירות Audiovisuel, EPFL) של צילום וידאו ועריכה של הסרט.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
