خلية واحدة القياس الكمي لمعدلات تحلل البروتين بالأسفار الوقت الفاصل بين الفحص المجهري في ثقافة الخلية ملتصقة
Summary
ويصف هذا البروتوكول أسلوب لتحديد البروتين التنصيف في الخلايا الحية واحدة ملتصقة، استخدام وسم نبض وتصوير الوقت الفاصل بين الأسفار المفاجئة، العلامة الانصهار البروتينات.
Abstract
البروتينات في حالة ديناميكية من التوليف ويمكن ضبط التدهور والنصف حياتهم تحت ظروف مختلفة. ولكن الأكثر استخداماً النهج لتحديد عمر البروتين أما أن تكون محدودة إلى متوسطات السكان من تفكيك الخلايا أو تتطلب استخدام مثبطات توليف البروتين. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس البروتين التنصيف في الخلايا الحية واحدة ملتصقة، استخدام الأداة الإضافية-العلامة الانصهار البروتينات في تركيبة مع الأسفار الوقت الفاصل بين الفحص المجهري. يمكن ربط أي البروتين من الفائدة التي تنصهر فيها علامة مبكرة تساهمي بصبغة نفاذية خلية فلورسنت، ويقترن بمشتق بينزيلجوانيني، ويمكن رصد انحلال السكان البروتين المسمى بعد تبييض للصبغة المتبقية. اللاحقة خلية تتبع والتحديد الكمي لشدة الأسفار المتكاملة على مر الوقت النتائج في منحنى اضمحلال أسي لكل خلية يتم تعقبها، مما يسمح لتحديد معدلات تحلل البروتين في الخلايا المفردة بملائمة منحنى. يوفر هذا الأسلوب تقديراً لعدم تجانس التنصيف في عدد أن خلايا المزروعة، التي لا يمكن تقييمها بسهولة بطرق أخرى. النهج الذي قدم هنا تنطبق على أي نوع من خلايا ملتصقة مثقف معربا عن وتين فائدة التي تنصهر فيها علامة مبكرة. هنا نستخدم الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الماوس نمت على ألواح الخلايا المغلفة من كادهيرين ه الثقافة لتوضيح تردي خلية واحدة كيف يمكن تحديد معدلات البروتينات مع طائفة واسعة من إنصاف.
Introduction
من المعروف جيدا أن البروتينات الخلوية الخضوع دوران واسعة النطاق، مع معدلات التوليف وتدهور يجري محددة لكل البروتين وتخضع للتنظيم الفسيولوجي. تقليديا، كانت معدلات تحلل البروتين يقاس باستخدام أساليب السائبة، مثل تحليل تشيس نبض المشعة، أو إشراك مثبطات توليف البروتين مثل سيكلوهيكسيميدي1. في الآونة الأخيرة، أنشأ النظائر المستقرة وسم مع الأحماض الأمينية في الخلية والثقافة (سيلك) في تركيبة مع الطيف الكتلي لقياس معدل دوران البروتين على نطاق عالمي2. بيد أن هذه الأساليب هي محدودة من السكان في المتوسط ولذلك يتم فقدان المعلومات حول تقلب خلية بخلية. وعلاوة على ذلك، لا يمكن تحديد تغيرات عابرة في تدهور البروتين التي هي غير متزامنة عبر سكان الخلية.
بدلاً من ذلك، يمكن أيضا تحديد البروتين التنصيف بالنهج المستندة إلى الأسفار، التي غالباً ما تتميز بتقديم القرار خلية واحدة. على سبيل المثال، استخدمت بروتين فلوري أخضر فوتواكتيفاتابل (باجفب) لتحديد نصف عمر Oct4 في جنين الثدييات المبكر3. هناك طريقة أخرى لرصد تحلل البروتين في الخلايا الحية هو استخدام علامة مبكرة في تركيبة مع الأسفار الوقت الفاصل بين التصوير. علامة مبكرة هو نسخة متحولة من الحمض النووي إصلاح إنزيم س6-الكيلجوانيني الحمض النووي–الكيلترانسفيراسي (AGT) الذي يتفاعل مع بينزيلجوانيني على وجه التحديد المشتقات (حرس الحدود)، الذي يمكن أن يكون بالإضافة إلى المسابر الجزيئية4،5، 6. ولذلك، لا رجعة فيه المسمى البروتين الانصهار أي علامة مبكرة مع صبغة نفاذية خلية فلورسنت،. نبض وسم من بروتين فائدة التي تنصهر فيها الأداة العلامة، تليها تبييض للصبغة المتبقية، يسمح لرصد تدهور البروتين المسمى السكان وبالتالي لتحديد عمر البروتين. العلامات الإضافية التي استخدمت بنجاح لمطاردة نبض وسم البروتينات وتحديد البروتين الخلية التنصيف ملتصقة في الثقافة و في فيفو5،7،،من89. مجموعة كبيرة ومتنوعة من ركائز علامة مبكرة تغطي استخداماً أطياف فلورسنت متوفرة تجارياً، مما يتيح اختيار صبغ المثلى لكل تطبيق معين. وهكذا، يمكن أيضا استخدام العلامات الإضافية للتصوير متعدد الألوان بالاقتران مع غيرها من البروتينات الفلورية الانصهار أو الأصباغ. خلية كتيمة الأصباغ تصلح لوسم البروتينات الغشاء المربوطة، بينما الأصباغ نفاذية الخلية قابلة للتطبيق لرصد البروتينات داخل الخلية والغشاء زمنياً. وعلاوة على ذلك، بعض هذه المسابر يحمل تقريبا لا الأسفار القاعدية وتبدأ فقط التي تنبعث منها إشارة نيون قوية عند الربط ب الأداة إضافية-علامة10.
ويصف هذا البروتوكول كيفية قياس معدلات تدهور البروتينات المختلفة ذات الاهتمام في الخلايا المفردة باستخدام الأداة إضافية-علامة. هنا يمكننا تطبيق هذا الأسلوب للخلايا الجذعية الجنينية (ES) الماوس المستزرعة في ه-كادهيرين، ولكن ينبغي أن يكون من الممكن استخدامها مع أي نوع من الخلايا المستزرعة ملتصقة. نحن تبين أن نبض وسم البروتينات الانصهار علامة مبكرة تليها fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير يسمح لتحديد خلية مفردة التنصيف من البروتينات المختلفة ذات الاهتمام ويوفر تقدير لتباين التنصيف في خلية إلى خلية سكان خلايا المستزرعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أن الخطوة الأكثر أهمية عند استخدام علامة مبكرة لرصد تحلل البروتين لضمان أن أي صبغة غير منضم المتبقية متروك في الأجل المتوسط أو في الخلايا بعد الغسيل، على خلاف ذلك قد ربط حديثا إنتاج الجزيئات الإضافية-الوسم في وقت لاحق أثناء التجربة، وهناك أبي الحل الوسط منحنى الاضمحلال. وهذا يتحقق بتنفيذ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأجريت تجارب الوقت الفاصل بين الفحص المجهري في الجزيئية البيولوجية فحص مرفق (قوات حرس الحدود)، لوزان. ونحن نشكر مارك ديلاتشاوكس (خدمة البصري السمعي، لوزان) بالفيديو وتحرير الفيلم.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
