Summary

単一細胞付着性細胞培養のタイムラプス蛍光顕微鏡による蛋白質分解率の定量化

Published: February 04, 2018
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Summary

このプロトコルでは、蛋白質半減単一接着細胞、パルスのラベリングとスナップ タグ融合タンパク質の蛍光タイムラプス イメージングを使用してを決定する方法について説明します。

Abstract

タンパク質合成の動的な状態で、劣化と半減を様々 な状況下で調整できます。しかし、最もよく使われるアプローチ タンパク質の半減期を判断するには、いずれかにタンパク質合成阻害剤の使用を必要とするまたは分離細胞から人口平均に限定。このプロトコルでは、測定蛋白質半減単一接着細胞、内スナップ タグ融合タンパク質を蛍光タイムラプス顕微鏡と組み合わせて使用する方法について説明します。スナップ タグに融合した興味のすべての蛋白質は、benzylguanine 誘導体に蛍光、結合は細胞透過性色素による共有結合することができます、残留色素のウォッシュ アウト後の分類された蛋白質の人口の崩壊を監視できます。その後細胞を追跡および曲線当てはめによる単一細胞における蛋白質分解率の決定を可能にする履歴セルごとに指数関数的減衰曲線の時間の結果の統合の蛍光強度の定量化。このメソッドは、他の方法で評価することはできません簡単に培養細胞の人口の半分の生活の不均一性の推定値を提供します。ここで紹介した方法は、スナップ タグに融合した興味の蛋白質を表現する培養された付着性のセルの任意の型に適用されます。ここで E カドヘリン被覆細胞培養皿上に成長したマウス胚性幹 (ES) 細胞を使用してどのように単一電池の劣化によりタンパク質の半減の広い範囲で料金を定めることができるを示します。

Introduction

細胞蛋白質が合成と分解率の各蛋白質の生理学的規制の対象は特定されている広範な売り上げ高を受けることが知られています。従来、蛋白質分解率は測定された放射性パルス追跡分析など、一括方法またはタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド1などを含むされています。最近では、地球規模2タンパク質代謝回転を定量化する安定同位体標識質量分析法との組み合わせで細胞培養 (SILAC) のアミノ酸と定めております。これらのメソッドは、人口の平均によって制限され、細胞間の変動についての情報が失われるため。さらに、細胞集団間で非同期タンパク質分解の一時的な変更を識別できません。

また、タンパク質の半減は、蛍光ベースのアプローチは、多くの場合単一セルの解像度を提供することの利点があるによって決定することができます。たとえば、活性型緑色蛍光タンパク質 (paGFP) は、初期の哺乳類の胚3Oct4 半減期を決定するため使用されています。細胞内タンパク質崩壊を監視する別の方法は、蛍光タイムラプス イメージングとの組み合わせでスナップ タグの使用です。スナップ タグは変異 DNA 修復酵素 O6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) 特に (BG) 誘導体、分子プローブ4,5,に結合することができます benzylguanine と反応して、バージョン6。 したがって、任意のスナップ タグ融合タンパク質が不可逆的蛍光、細胞透過性色素をラベルすることができます。パルスが残留色素の流失が続くスナップ タグに融合した興味の蛋白質の分類の分類された蛋白質の人口の低下を監視され、そのタンパク質の半減期を求めることができます。スナップ タグは正常にパルス追跡は蛋白質の分類に使用されている、タンパク質を決定するため半減付着細胞文化とin vivo5,7,8,9。一般的に使用されるカバー スナップ タグ基板の大規模な様々 な蛍光スペクトル、市販、特定のアプリケーションに対して最適な染料の選択を有効にします。したがって、スナップイン タグは、他の蛍光融合タンパク質や色素と組み合わせてマルチカラー イメージングを使用もできます。細胞不透過性色素は、細胞膜透過性の色素が細胞内と膜結合タンパク質のモニタリングに適用、つなが膜蛋白質の分類に適しています。さらに、これらのプローブのいくつかはほとんどない基底の蛍光を展示し、スナップ タグ10へのバインド時に強力な蛍光信号を発光のみで開始。

このプロトコルでは、スナップ タグを使用して単一セルの興味の異なった蛋白質の分解速度を測定する方法について説明します。ここでは、E-カドヘリンの培養マウス胚性幹 (ES) 細胞に本手法を適用が、付着性の培養されたセルの任意の型を使用する可能であるべきです。示すパルス標識蛍光タイムラプス イメージング続いてスナップ タグ融合タンパク質の興味の様々 な蛋白質の 1 つのセルの半減を決定することができます半減の細胞間の可変性の見積もりを提供します、培養細胞の人口。

Protocol

注: この研究で E14 ES 細胞ラインが使用されました。しかし、このプロトコルは、他のスナップ タグ内因性のタンパク質のタグ付けまたは過剰発現による融合した興味の蛋白質を表現するマウス ES 細胞ラインには直接適用。結果のセクションで示した例では、ドキシサイクリン誘導スナップ タグ融合細胞は使用された (次の蛋白質に融合したスナップ タグ: Nanog、Oct4、Srsf11、または蛍光タン?…

Representative Results

記述のプロトコルは、スナップ タグに融合蛋白質の半減期で細胞間の可変性の見積もりを提供します。イメージング プレートのコーティング用組換え E-カドヘリン – fc 使用できますそれ以外の植民地に自生する ES 細胞の単一セルの解像度。単一のセルは、映画 (図 1 a) のコースを通して個別に追跡できます。 各単一セルの蛋白質の半減期を決定す…

Discussion

最も重要なステップ、残留非連結色素が残っていないか確認培地でも細胞としてそれ以外の場合は、洗浄後それを可能性がありますにバインド新しくスナップ タグを使用して蛋白質の腐敗を監視する、生産実験とそこの間に後でスナップ タグ分子イービ減衰曲線を危険にさらします。これは慎重に記載されている洗濯のすべての手順を実行することによって達成される 1 つの手です。その?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

微速度顕微鏡観察実験で、生体分子スクリーニング施設 (BSF)、スイス連邦工科大学に行った。ありがとう Marc Delachaux (視聴覚サービス、スイス連邦工科大学)、ビデオ撮影と映画の編集します。

Materials

Equipment
ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 353003
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate Corning 353219
Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm Marienfeld-superior 640030
CO2 Incubator Panasonic MCO-170AICUV-PE
Centrifuge 5804 R Eppendorf 5804000528
InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System GE Healthcare Life Sciences 29027886
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Glasgow Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich G5154
Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified ThermoFisher 16141-079
Sodium pyruvate solution Sigma-Aldrich 113-24-6
Minimum Essential Medium  Non-Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-035
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00H
L-Glutamine 200mM ThermoFisher 25030-024
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689-25ML-F
Leukemia Inhibitory factor Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. 
CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) Merck Millipore 361559
PD 0325901 Sigma-Aldrich 391210-10-9
Gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Dulbecco's PBS 10x concentrated BioConcept 3-05K00-I
Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ BioConcept 3-05F29-I
Trypsin-EDTA-Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049
Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein R&D systems 748-EC-050
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
SNAP-Cell 647-SiR New England BioLabs S9102S
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A18967-01
Name Company Catalog Number Comments
Software
FIJI Open-source image analysis software
MATLAB R2014a Mathworks
Microsoft Excel Microsoft

References

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Cite This Article
Alber, A. B., Suter, D. M. Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56604, doi:10.3791/56604 (2018).

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