अनुयाई सेल कल्चर में समय-चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन ह्रास दरों की एकल-कोशिका ठहराव
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि प्रोटीन आधा निर्धारित करने के लिए एक जीवित अनुयाई कोशिकाओं में रहता है, नाड़ी लेबलिंग और स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन के प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर ।
Abstract
प्रोटीन संश्लेषण और क्षरण की एक गतिशील स्थिति में हैं और उनके आधे जीवन विभिन्न परिस्थितियों के तहत समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण प्रोटीन आधा जीवन निर्धारित करने के लिए या तो लीजड कोशिकाओं से जनसंख्या औसत तक ही सीमित है या प्रोटीन संश्लेषण अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल एक विधि को मापने के लिए प्रोटीन आधा एकल जीवन अनुयाई कोशिकाओं में रहता है, स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन के साथ संयोजन में प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का वर्णन करता है । ब्याज की कोई प्रोटीन एक तस्वीर से जुड़े-टैग एक फ्लोरोसेंट, सेल पारगंय डाई कि एक benzylguanine व्युत्पंन के लिए युग्मित है, और लेबल प्रोटीन आबादी के क्षय से बंधे covalently जा सकता है अवशिष्ट डाई के वॉशआउट के बाद निगरानी की जा सकती है । बाद में सेल ट्रैकिंग और ठहराव एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता के समय पर प्रत्येक ट्रैक सेल के लिए एक घातीय क्षय वक्र में परिणाम, वक्र फिटिंग द्वारा एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट दर का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है । यह विधि कल्चरल कोशिकाओं की जनसंख्या में आधे जीवन के विविधता के लिए एक अनुमान प्रदान करती है, जिसे अन्य विधियों द्वारा आसानी से नहीं आंका जा सकता है । दृष्टिकोण यहां प्रस्तुत की संस्कृति अनुयाई एक स्नैप-टैग से जुड़े ब्याज की एक प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के लिए लागू है । यहां हम माउस भ्रूण स्टेम का उपयोग करें (ES) E-cadherin-लेपित सेल संस्कृति प्लेटों पर हो कोशिकाओं को वर्णन कैसे आधा जीवन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रोटीन के एक सेल गिरावट दर निर्धारित किया जा सकता है ।
Introduction
यह सर्वविदित है कि सेलुलर प्रोटीन एक प्रोटीन और शारीरिक विनियमन के अधीन के लिए विशिष्ट किया जा रहा संश्लेषण और गिरावट दरों के साथ, व्यापक कारोबार से गुजरना है । परंपरागत रूप से, प्रोटीन क्षरण दरों ऐसे रेडियोधर्मी पल्स चेस विश्लेषण के रूप में थोक तरीकों, का उपयोग कर मापा गया है, या cycloheximide1के रूप में प्रोटीन संश्लेषण अवरोधों को शामिल. हाल ही में, स्थिर आइसोटोप मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में सेल संस्कृति (SILAC) में अमीनो एसिड के साथ लेबलिंग एक वैश्विक स्तर पर प्रोटीन कारोबार के लिए स्थापित किया गया है2. हालांकि, इन पद्धतियों जनसंख्या औसत द्वारा सीमित हैं, और कक्ष-से-कक्ष परिवर्तनशीलता के बारे में जानकारी इसलिए खो जाती है । इसके अलावा, प्रोटीन क्षरण में परिवर्तनीय परिवर्तन है कि सेल की आबादी के पार अनसिंक्रनाइज़ कर रहे है पहचाना नहीं जा सकता ।
वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन आधा जीवन भी प्रतिदीप्ति आधारित दृष्टिकोण है, जो अक्सर एकल सेल संकल्प प्रदान करने का लाभ है द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक photoactivatable ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (paGFP) के लिए Oct4 आधा जल्दी स्तनधारी भ्रूण में जीवन का निर्धारण किया गया है3। एक अंय विधि रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन क्षय की निगरानी करने के लिए एक स्नैप-प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग के साथ संयोजन में टैग का उपयोग है । तस्वीर टैग डीएनए की मरंमत एंजाइम ओ6-alkylguanine डीएनए-alkyltransferase (AGT) है कि विशेष रूप से benzylguanine (BG) डेरिवेटिव है, जो आणविक जांच करने के लिए युग्मित किया जा सकता है के साथ प्रतिक्रिया के एक उत्परिवर्ती संस्करण है4,5, 6. इसलिए, किसी भी स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट, सेल पारगंय डाई के साथ लेबल अचल जा सकता है । पल्स ब्याज की एक प्रोटीन के लेबल स्नैप-टैग से जुड़े, अवशिष्ट डाई के वॉशआउट द्वारा पीछा किया, लेबल प्रोटीन जनसंख्या के क्षरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार प्रोटीन आधा जीवन निर्धारित करने के लिए । स्नैप-टैग सफलतापूर्वक प्रोटीन का पीछा लेबलिंग और अनुयाई सेल संस्कृति में प्रोटीन आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए और vivo में5,7,8,9के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्नैप-टैग के एक विशाल विविधता आमतौर पर फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा इस्तेमाल को कवर सब्सट्रेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, प्रत्येक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए इष्टतम डाई के चयन को सक्षम करने से । इस प्रकार, स्नैप-टैग भी बहुरंगा इमेजिंग के लिए अन्य फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन या रंजक के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिका-अभेद्य रंजक झिल्ली-tethered प्रोटीन के लेबल के लिए उपयुक्त हैं, जबकि कोशिका-पारगंय रंजक दोनों intracellular और झिल्ली से बंधे प्रोटीन की निगरानी के लिए लागू कर रहे हैं । इसके अलावा, इन जांच के कुछ लगभग कोई बेसल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन और केवल एक तस्वीर के लिए बाध्यकारी पर एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन शुरू-10टैग ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक स्नैप-टैग का उपयोग कर एकल कोशिकाओं में ब्याज की विभिंन प्रोटीन की गिरावट दर को मापने के लिए । यहाँ हम माउस भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं ई-cadherin पर कल्चरित करने के लिए इस विधि लागू करते हैं, लेकिन यह किसी भी अनुयाई कल्चरल सेल प्रकार के साथ उपयोग करने के लिए संभव होना चाहिए. हम बताते हैं कि पल्स लेबलिंग स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन के बाद प्रतिदीप्ति समय-चूक इमेजिंग की अनुमति देता है एकल सेल आधे का निर्धारण करने के लिए ब्याज की विभिन्न प्रोटीन के जीवन और सेल के लिए एक अनुमान प्रदान करता है-कोशिका में आधा जीवन की परिवर्तनशीलता कल्चरल कोशिकाओं की जनसंख्या.
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण कदम जब एक तस्वीर-टैग का उपयोग करने के लिए प्रोटीन क्षय की निगरानी के लिए सुनिश्चित करें कि कोई अवशिष्ट असीम डाई मध्यम में या धोने के बाद कोशिकाओं में छोड़ दिया है, अंयथा यह नए उत्पादित स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
समय-चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए, EPFL आणविक जांच सुविधा (बीएसएफ) में प्रदर्शन किया गया । हम वीडियोग्राफी और फिल्म के संपादन के लिए मार्क Delachaux (सेवा Audiovisuel, EPFL) धंयवाद ।
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
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