Detectie en verwijdering van de Nuclease besmetting tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van recombinante Prototype schuimend Virus Integrase
Summary
Recombinante prototype schuimend virus integrase eiwit is het vaak besmet met een bacteriële nuclease tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Deze methode nuclease besmetting identificeert en verwijdert het uit de definitieve opstelling van het enzym.
Abstract
Het eiwit integrase (IN) van het retrovirus prototype schuimend virus (PFV) is een enzym model voor het bestuderen van het mechanisme van retrovirale integratie. In vergelijking met IN van andere retrovirussen, is PFV IN meer oplosbaar en meer vatbaar voor experimentele manipulatie. Bovendien is de gevoelig voor klinisch relevante humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) IN remmers, suggereren dat het katalytische mechanisme van PFV IN vergelijkbaar met is dat van HIV-1 IN. IN katalyseert de covalente verbinding van virale cDNA (cDNA) naar doel DNA in een proces genaamd strand overdracht. Deze reactie van de overdracht deel introduceert nicks aan het DNA van het doel. Analyse van integratie reactieproducten kan worden verward door de aanwezigheid van nucleasen die ook nick DNA. Een bacteriële nuclease heeft aangetoond dat mede zuiveren met recombinant PFV IN uitgedrukt in Escherichia coli (E. coli). Hier beschrijven we een methode om te isoleren PFV IN van de besmettende nuclease door de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Breuken zijn gemakkelijk gescreend nuclease besmetting met een supercoiled plasmide en agarose gel electroforese. PFV IN en de besmettende nuclease weergegeven alternatieve affiniteiten voor heparine sepharose waardoor een nuclease-vrije opstelling van recombinante PFV IN geschikt voor bulk biochemische of één molecuul analyse van integratie.
Introduction
Biochemische en één molecuul studies eiwitinteractie met DNA vereisen uitzonderlijk zuivere recombinante eiwitten. Contaminerende nucleasen van bacteriën kan onzichtbaar maakt de resultaten van deze tests. Een contaminerende nuclease heeft gevonden in de voorbereidingen van recombinante eiwitten zuurstof scavenger protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) en prototype schuimend virus (PFV) integrase (IN) geïsoleerde van Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.
Retrovirale integratie testen is afhankelijk van de conversie van supercoiled DNA naar gejat of lineaire producten als een maatregel van IN activiteit4. Tijdens de cellulaire infectie IN sluit zich aan bij de twee uiteinden van een virale cDNA naar de host chromatine5. Elk uiteinde toetreding tot reactie heet strand overdracht. Testen van recombinante IN activiteit kan toetreden twee DNA oligomeren nabootsen van virale cDNA eindigt aan een doelDNA in een onderling afgestemde feitelijke integratie reactie4,5,6,7,8. Als alternatief kunt recombinante IN slechts één DNA einde deelnemen in een niet-fysiologisch relevante halve site integratie reactie9,10. Wanneer supercoiled plasmide DNA de doelstelling van is integratie, gecoördineerde integratie producten zijn gelineariseerde DNA en halve site integratie producten zijn ontspannen cirkels. Deze reactieproducten worden geïdentificeerd door hun relatieve mobiliteit tijdens agarose gel elektroforese1. Als de recombinante IN een contaminerende nuclease heeft, zal er valse ontspannen cirkels of een eventueel gelineariseerde plasmide verwarrend de experimentele resultaten. Virale DNA oligomeren kunnen fluorescently worden aangeduid om overtuigend integratie producten, in tegenstelling tot de nuclease producten vast te stellen. Echter, gunsten sterk IN supercoiled DNA doelstellingen; enig verlies van supercoiled plasmide te ontspannen cirkels of lineaire DNA door contaminerende nuclease kan scheeftrekken resultaten en interpretatie van gegevens11. Het is dus absoluut noodzakelijk om bacteriële nucleasen van retrovirale IN preparaten.
PFV IN heeft een verschillende affiniteit voor heparine sepharose ten opzichte van de bacteriële nuclease1. PFV IN en de nuclease mogen worden gescheiden door een lineaire gradiënt elutie van heparine sepharose. De nuclease is niet gemakkelijk gedetecteerd door een ultraviolet (UV)-absorptie bij 280 nm piek of polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor analytische natrium dodecyl sulfaat. In plaats daarvan wordt de nuclease gedetecteerd door een nuclease activiteit assay met de conversie van een supercoiled plasmide naar ontspannen cirkels of lineaire producten. Elke breuk na heparine sepharose chromatografie is getest voor nuclease activiteit. PFV IN en de nuclease verontreiniging hebben geen verschil in affiniteit voor Mono-Q anion hars. Er is een klein verschil in affiniteit voor Mono-S catie hars. De resolutie van de Mono-S van bacteriële nuclease en PFV IN zou echter niet toestaan dat efficiënte scheiding van de eiwitten. Uiteindelijk, heparine sepharose affiniteit zuivering biedt de beste scheiding van bacteriële nuclease van PFV IN en heeft het voordeel van onbeperkte belasting volume.
Testen voor besmetting van de nuclease activiteit kan worden aangepast aan andere eiwitten. De proteïne van belang zal waarschijnlijk hebben alternatieve affiniteit kenmerken dan PFV IN; het verschil in de kenmerken van de proteïne van belang en de verontreiniging van de nuclease bindend moet empirisch worden bepaald. Deze methodologie voor het identificeren van de nuclease verontreiniging kan worden aangepast aan andere harsen met inbegrip van Mono-S catie of Mono-Q anion uitwisseling harsen. Affiniteit en ionenwisseling harsen kunnen bieden een betrouwbare methode om te isoleren een recombinant proteïne van belang van contaminerende nucleasen met geen limiet op de hoeveelheid eiwit tijdens chromatografie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recombinante eiwitten die interactie met DNA, zoals DNA repair eiwitten, zuurstof aaseters voor enkel molecuul microscopie toepassingen of retrovirale integrases, moeten vrij zijn van contaminerende bacteriële nucleasen2,3. Deze verontreinigingen kunnen verwarren de interpretatie van resultaten tijdens bulk biochemische of één molecuul testen.
We hebben gevonden dat een bacteriële nuclease vaak mede met PFV IN. zuivert PFV IN wordt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH AI099854 en de AI126742 sleutel.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
- Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
- Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
- Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
