組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去
Summary
組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼ タンパク質は精製時に細菌ヌクレアーゼと頻繁に汚染されています。このメソッドは、ヌクレアーゼの混入を識別し、酵素の最終的な準備から削除します。
Abstract
レトロ ウイルス プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) のインテグラーゼ (IN) タンパク質は、レトロ ウイルスの統合のメカニズムを研究するためのモデル酵素です。他のレトロ ウイルスからのに比べて、PFV ではより水溶性と実験操作に向いています。さらに、臨床的に関連するひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の阻害剤、PFV での触媒機構がウイルス相補的 DNA (cDNA) ターゲットの共有結合に参加する HIV 1 インチのすることに似ていることを示唆しているに敏感です。プロセスの DNA では、ストランドの転送と呼ばれます。この鎖転移反応は、ターゲット DNA にニックを紹介します。統合反応生成物の分析は、同様にニック DNA 核酸の存在によって混同することができます。細菌ヌクレアーゼは、組換え PFV のエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 単位で共同浄化するために示されています。ここでヘパリン親和性クロマトグラフィーによる汚染のヌクレアーゼから PFV を分離する手法について述べる。分数は、スーパーのプラスミドと agarose のゲルの電気泳動のヌクレアーゼの混入のため簡単に上映されます。PFV および汚染のヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズ統合の一括生化学的または単一分子解析に適した遺伝子組換え PFV のヌクレアーゼ フリーの準備を許可するため代替の親和性を表示します。
Introduction
蛋白質 DNA 相互作用の生化学的および単一分子の研究は、非常に純粋な組換えタンパク質を必要とします。これらのアッセイの結果を隠すことが汚染細菌の核酸分解酵素。汚染ヌクレアーゼは、組換えタンパク質酸素スカベン ジャー プロトカテク酸–3, 4-ジオキシゲナーゼ (PCD) とエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌)1から分離したプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) インテグラーゼ (IN) の準備で発見されています。,2,3。
レトロ ウイルスの統合の試金は、活動4の対策としてスーパー コイル DNA の刃こぼれしたりリニア製品への変換に依存します。細胞の感染ではウイルスの cDNA の 2 つの端をホスト クロマチン5に結合します。反応に参加する各端は、ストランドの転送と呼ばれます。アッセイの組換えの活動参加 2 つの DNA オリゴマー協調統合反応4,5,6,7,8でターゲット DNA に終了ウイルスの cDNA を模倣しました。また遺伝子組換えでは、非生理関連の半分サイト統合反応9,10で一端のみの DNA を結合するかもしれない。スーパー プラスミッド DNA のターゲットである統合、共同統合製品は、線形 DNA と半分のサイト統合製品は、リラックスしたサークル。これら反応生成物は agarose のゲルの電気泳動の1中の相対移動によって識別されます。遺伝子組換え汚染ヌクレアーゼ持ち、スプリアスのリラックスしたサークルや実験結果を混乱可能性線形プラスミッドがあるでしょう。ウイルスの DNA オリゴマーは、決定的ヌクレアーゼ製品ではなく、統合製品を識別するために蛍光に分類することがあります。ただしで大きくスーパー DNA ターゲットを支持します。スーパー プラスミドをリラックスしたサークルや汚染ヌクレアーゼによる線形 DNA の損失は結果とデータ11の解釈を歪めます。こうして準備でレトロ ウイルスから細菌の核酸を削除することが不可欠です。
PFV では、ヘパリン セファローズ細菌ヌクレアーゼ1と比較して、異なる親和性を持ってください。PFV とヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズから線形勾配溶出によって切り離されるかもしれない。ヌクレアーゼは、280 nm のピーク時に紫外線 (UV) 吸収すること分析ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって容易には検出されません。代わりに、ヌクレアーゼ スーパー プラスミドのリラックスしたサークルやリニア製品への変換を用いたヌクレアーゼ活性検出します。各分画ヘパリン セファローズ クロマトグラフィーを次のヌクレアーゼ活性テストされます。PFV とヌクレアーゼ汚染モノ Q 陰イオン樹脂の親和性には違いがあります。モノ S 陽イオン樹脂の親和性の差があります。しかし、細菌のヌクレアーゼと PFV のモノ S 解像度はタンパク質の効率的な分離を許さなかった。最終的には、ヘパリン セファローズ親和性の浄化は PFV IN から細菌ヌクレアーゼの最高の分離を提供して無制限の量の利点をいます。
ヌクレアーゼ活性の汚染のためのテストは、他の蛋白質に適応させること。興味の蛋白質は PFV の; より代替親和性特性に可能性が結合の関心とヌクレアーゼ汚染タンパク質の特性の違いは経験的に決まります。ヌクレアーゼの混入を識別するためのこの方法はモノ S 陽イオンまたはモノラル Q 陰イオン交換樹脂を含むその他の樹脂に適応させること。親和性とイオン交換樹脂クロマトグラフィー中タンパク質の量に制限のない核酸の汚染からの興味の組換えタンパク質を分離するための信頼できる方法があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 修復タンパク質 1 分子顕微鏡アプリケーション、またはレトロ ウイルス integrases の酸素スカベン ジャーなど DNA と相互作用する組換えタンパク質は汚染細菌核酸2,3の無料する必要があります。これらの汚染物質は、一括生化学的または単一分子アッセイ中に結果の解釈を混乱させるかもしれません。
我々 は、細菌のヌクレ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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