Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa
Summary
Proteína de integrasa prototipo recombinante virus espumoso está a menudo contaminada con una nucleasa bacteriana durante la purificación. Este método identifica la contaminación nucleasa y lo quita de la preparación final de la enzima.
Abstract
La proteína integrasa (IN) de los virus espumoso del prototipo de retrovirus (PFV) es una enzima de modelo para estudiar el mecanismo de integración retroviral. Comparado con el IN de otros retrovirus, en PFV es más soluble y más susceptibles a la manipulación experimental. Además, es sensible a los inhibidores IN clínicamente relevantes virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1), sugiriendo que el mecanismo catalítico de PFV es similar a la que del VIH-1 in en cataliza la unión covalente de viral DNA complementaria (cDNA) al destino ADN en un proceso llamado transferencia de cadena. Esta reacción de transferencia de cadena presenta mellas el ADN diana. Análisis de productos de la reacción de integración puede ser confundido por la presencia de nucleasas que igualmente nick ADN. Una nucleasa bacteriana se ha demostrado para purificar conjuntamente con PFV recombinante expresado en Escherichia coli (e. coli). Aquí se describe un método para aislar en PFV de nucleasas contaminantes por cromatografía de afinidad de heparina. Fracciones son fácilmente evaluadas por contaminación de nucleasa con un plásmido superenrollado y electroforesis en gel de agarosa. EN PFV y nucleasas contaminantes muestran afinidades alternativas para heparina sepharose permitiendo una preparación libre de nucleasa de recombinantes en PFV adecuado para análisis bioquímicos o de una sola molécula de a granel de la integración.
Introduction
Estudios bioquímicos y una sola molécula de interacciones de proteínas con ADN requieren proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminando las nucleasas de bacterias puede ocultar los resultados de estos ensayos. Una nucleasa contaminante se ha encontrado en preparaciones de proteínas recombinantes oxígeno carroñero protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) y prototipo virus espumoso (PFV) integrasa (IN) aislados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensayos de integración retroviral se basan en la conversión de ADN superenrollado productos mellada o lineal como una medida de la actividad4. Durante la infección celular IN se une a los dos extremos de un cDNA viral al host cromatina5. Cada extremo a la reacción se denomina transferencia de cadena. Ensayos del recombinante en actividad puede unirse dos oligomeros DNA mímico el cDNA viral termina con un objetivo de ADN en una reacción de integración concertada de5,4,6,7,8. Alternativamente IN recombinante puede unirse solamente un extremo de ADN en un sitio medio no fisiológico relevante integración reacción9,10. Cuando DNA plasmídico superenrollado es el objetivo de integración, integración concertada son productos lineal ADN y medio productos de integración son círculos relajados. Estos productos de reacción son identificados por su movilidad relativa en gel de agarosa electroforesis1. Si la IN recombinante tiene una nucleasa contaminante, habrá falsos círculos relajados o un plásmido linearizado posiblemente confundir los resultados experimentales. Oligómeros de DNA virales pueden etiquetarse fluorescencia para identificar concluyente productos de integración, en comparación con productos de nucleasa. Sin embargo, en gran medida favorece objetivos de ADN superenrollados; cualquier pérdida del plásmido superenrollado círculos relajados o DNA linear por nucleasas contaminantes podría sesgar resultados e interpretación de datos11. Así es indispensable para quitar las nucleasas bacterianas de retrovirales en los preparativos.
PFV en tiene una afinidad diferente para sepharose heparina en comparación con la de nucleasas bacterianas1. PFV en y la nucleasa pueden estar separados por una elución gradiente lineal de sepharose de heparina. La nucleasa no se detecta fácilmente por una absorbancia (UV) ULTRAVIOLETA en pico nm 280 o por electroforesis en gel de poliacrilamida analítica sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE). En cambio, la nucleasa es detectado por un análisis de la actividad de nucleasa utilizando la conversión de un plásmido superenrollado en círculos relajados o productos lineales. Cada fracción siguiente cromatografía de sepharose de heparina se comprueba actividad nucleasa. PFV en y el contaminante de nucleasa no tienen ninguna diferencia en la afinidad de la resina de anión Mono-Q. Hay una pequeña diferencia en la afinidad de la resina de catión Mono-S. Sin embargo, la resolución Mono-S de nucleasas bacterianas y en PFV no permitiría la separación eficiente de las proteínas. En última instancia, heparina sepharose afinidad purificación ofrece la mejor separación de nucleasas bacterianas de PFV en y tiene la ventaja del volumen de carga ilimitado.
Pruebas de contaminación actividad nucleasa puede adaptarse a otras proteínas. La proteína de interés probablemente tendrá características de afinidad alternativos que PFV en; la diferencia de enlace características de la proteína de interés y el contaminante de nucleasa debe determinarse empíricamente. Esta metodología para identificar la contaminación de la nucleasa puede adaptarse a otras resinas como cationes Mono-S o resinas de intercambio de aniones Mono-Q. Resinas de afinidad e intercambio iónico pueden ofrecer un método confiable para aislar una proteína recombinante de interés contaminen las nucleasas sin límites en el volumen de proteína durante la cromatografía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteínas recombinantes que interactúan con el ADN, tales como proteínas, depuradores de oxígeno para aplicaciones de microscopía sola molécula o integrases retroviral, de reparación del ADN deben estar libres de contaminantes nucleasas bacterianas2,3. Estos contaminantes pueden confundir la interpretación de los resultados durante los ensayos bioquímicos o de una sola molécula a granel.
Hemos encontrado que una nucleasa bact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH AI099854 y AI126742 a la clave.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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