검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거
Summary
재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.
Abstract
레트로 바이러스 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 integrase (IN) 단백질은 retroviral 통합의 메커니즘 연구 모델 효소 이다. 다른 레트로 바이러스에서에 비해, PFV에 더 많은 가용성과 실험적인 조작에 순종. 또한, 그것은 임상으로 관련 된 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1)에 억제제, PFV에 촉매 메커니즘은 그의 HIV-1 인치에 catalyzes 바이러스 무료 DNA (cDNA) 대상의 공유 결합 비슷한 제안에 민감한 과정에서 DNA 가닥 전송을 이라고합니다. 이 물가 이동 반응 대상 DNA에 닉스를 소개합니다. 통합 반응 제품의 분석 nucleases 마찬가지로 DNA를 닉의 존재에 의해 혼동 될 수 있습니다. 세균성 nuclease 공동 재조합 PFV에 대장균 (대장균)에 표현 된 정화 표시 되었습니다. 여기 헤 파 린 친화성 크로마토그래피에 의해 오염 nuclease에서 PFV에 격리 하는 방법을 설명 합니다. 분수는 쉽게 supercoiled 플라스 미드와 agarose 젤 전기 이동 법 nuclease 오염에 대 한 상영 됩니다. PFV에 및 오염 nuclease nuclease 무료 준비 재조합 PFV에 통합의 대량 생 화 확 적인 또는 단일 분자 분석에 대 한 적합 한 허용 하는 헤 파 린 sepharose에 대 한 대체 선호도 표시 합니다.
Introduction
Dna 단백질 상호 작용의 생 화 학적 및 단일 분자 연구 매우 순수한 재조합 단백질을 필요로합니다. 박테리아에서 nucleases 오염 이러한 분석의 결과 모호한 수 있습니다. 오염 nuclease 재조합 단백질 산소 폐품 protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) 및 대장균 (대장균)1 에서 절연 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV) integrase (IN)의 준비에서 발견 되었습니다. , 2 , 3.
Retroviral 통합 분석 실험 활동4의 측정으로 긁어 또는 선형 제품 supercoiled DNA의 변환에 의존합니다. 세포 감염 동안에 호스트 chromatin5바이러스 성 cDNA의 두 끝에 합류 했다. 반응에 참여 하는 각 끝에는 스트랜드 전송 되 나 이다. 분석 실험 활동 두 DNA 올리고 참여 수 재조합에의 공동된 통합 반응4,,56,7,8에서 표적 DNA에 종료 바이러스 성 cDNA를 흉내 낸. 또는 재조합에 비 순수 관련 반 사이트 통합 반응9,10단 하나의 DNA 끝을 참여할 수 있습니다. Supercoiled 플라스 미드 DNA의 대상인 통합, 공동된 통합 제품은 오는지 DNA 고 반 사이트 통합 제품은 편안한 서클. 이러한 반응 제품 agarose 젤 전기 이동 법1동안 상대 그들의 이동성에 의해 식별 됩니다. 재조합에 오염 nuclease 있으면 가짜 편안한 원이나 실험 결과 혼란 가능성이 선형화 플라스 미드 있을 것입니다. 바이러스 성 DNA 올리고 nuclease 제품 반대로 통합 제품을 결정적으로 식별 하 붙일 표시 될 수 있습니다. 그러나,에서 크게 하시 더군요 supercoiled DNA 목표; 편안한 원 또는 오염 nuclease에 의해 선형 DNA supercoiled 플라스 미드의 손실 결과 및 해석 데이터11의 왜곡 수 있습니다. 따라서 세균 nucleases retroviral 준비에서에서 제거 하는 것이 필수적 이다.
PFV에 세균성 nuclease1에 비해 헤 파 린 sepharose에 대 한 다른 선호도 하고있다. PFV에 고는 nuclease 덤플링 sepharose에서 선형 그라데이션 차입에 의해 분리 될 수 있습니다. 280 nm 첨단 자외선 (UV) 흡 광도 또는 분석 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)는 nuclease 쉽게 감지 되지 않습니다. 대신,는 nuclease 편안한 원이나 선형 제품 supercoiled 플라스 미드의 전환 채용 nuclease 활동 분석 결과 의해 감지 됩니다. 헤 파 린 sepharose 크로마토그래피 다음 각 분수는 nuclease 활동에 대 한 테스트입니다. PFV에 nuclease 오염 물질 모노-Q 음이온 수 지에 대 한 선호도에 차이가 있다. 모노-S 양이온 수 지에 대 한 선호도에 작은 차이가 있다. 그러나, 세균성 nuclease 모노 S 해상도 PFV에 단백질의 효율적인 분리를 수 없습니다. 궁극적으로, 덤플링 sepharose 친 화력 정화 PFV에 세균성 nuclease의 최고의 분리를 제공 하 고 무제한 부하 볼륨의 이점이 있다.
오염 nuclease 활동에 대 한 테스트 다른 단백질을 적용할 수 있습니다. 관심사의 단백질 대체 선호도 특성 PFV에; 보다 가능성이 해야한다. 바인딩 관심과 nuclease 오염 물질의 단백질의 특성에 차이 실험적으로 결정 되어야 합니다. Nuclease 오염 식별이 방법론 모노-S 양이온 또는 모노-Q 음이온 교환 수 지를 포함 하 여 다른 수 지에 적용할 수 있습니다. 선호도 및 이온 교환 수 지는 크로마토그래피 중 단백질의 볼륨에 제한이 없는 nucleases 오염에서 재조합 단백질을 분리 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 복구 단백질, 단일 분자 현미경 검사 법 응용 프로그램, 또는 retroviral integrases 산소 청소부와 같은 DNA와 상호 작용 하는 재조합 단백질 오염 세균 nucleases2,3의 무료 되어야 합니다. 이러한 오염 물질은 동안에 대량 생물 또는 단일 분자 분석 실험 결과의 해석을 혼동 수 있습니다.
우리는 세균 nuclease 자주 공동 정화 PFV 인치와 발견 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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