पता लगाने और संयोजक प्रोटोटाइप फोम वायरस Integrase के शोधन के दौरान Nuclease संदूषण को हटाने
Summary
संयोजक प्रोटोटाइप फोम वायरस integrase प्रोटीन अक्सर शुद्धि के दौरान एक जीवाणु nuclease के साथ दूषित है । यह विधि nuclease संदूषण की पहचान करती है और इसे एंजाइम की अंतिम तैयारी से निकालती है ।
Abstract
integrase (में) retrovirus प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) के प्रोटीन सिंड्रम एकीकरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल एंजाइम है । अन्य retroviruses से में की तुलना में, में PFV अधिक घुलनशील है और अधिक प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी. इसके अतिरिक्त, यह नैदानिक प्रासंगिक मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी-1) में अवरोधकों के प्रति संवेदनशील है, सुझाव है कि में PFV के उत्प्रेरक तंत्र एचआईवी के समान है-1 में । catalyzes में वायरल पूरक डीएनए (सीडीएनए) के आबंध कार्यग्रहण को लक्ष्य एक प्रक्रिया में डीएनए कतरा स्थानांतरण कहा जाता है । इस किनारा हस्तांतरण प्रतिक्रिया लक्ष्य डीएनए को निक का परिचय । एकीकरण प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण nucleases की उपस्थिति है कि इसी तरह निक डीएनए द्वारा पाया जा सकता है । एक जीवाणु nuclease में व्यक्त किया गया है सह करने के लिए संयोजक PFV के साथ शुद्ध ई कोलाई (ई. कोलाई) । यहां हम हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा दूषित nuclease से PFV को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं । भागों आसानी से एक supercoiled प्लाज्मिड और agarose जेल ट्रो के साथ nuclease संदूषण के लिए जांच कर रहे हैं । PFV में और प्रदूषित nuclease हेपरिन sepharose के लिए वैकल्पिक समानताएं प्रदर्शित nuclease संयोजक की एक PFV मुक्त तैयारी के लिए उपयुक्त में थोक जैव रासायनिक या एकीकरण के एकल अणु विश्लेषण ।
Introduction
जैव रासायनिक और डीएनए के साथ प्रोटीन बातचीत के एकल अणु अध्ययन असाधारण शुद्ध संयोजक प्रोटीन की आवश्यकता है । बैक्टीरिया से दूषित nucleases इन परख के परिणाम अस्पष्ट कर सकते हैं । एक प्रदूषित nuclease की तैयारी में पाया गया है संयोजक प्रोटीन ऑक्सीजन मेहतर protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) और प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) integrase (में) ई कोलाई (ई. कोलाई) से पृथक1 , 2 , 3.
सिंड्रम एकीकरण परख supercoiled डीएनए के रूपांतरण पर निक या रैखिक उत्पादों के लिए गतिविधि में4के एक उपाय के रूप में भरोसा करते हैं । में सेलुलर संक्रमण के दौरान एक वायरल सीडीएनए के दोनों सिरों को होस्ट क्रोमेटिन5में मिलती है । प्रत्येक अंत में शामिल होने की प्रतिक्रिया कतरा स्थानांतरण करार है । गतिविधि में संयोजक की परख दो डीएनए वायरल सीडीएनए नकल उतारने में शामिल हो सकते है oligomers एक ठोस एकीकरण प्रतिक्रिया में एक लक्ष्य डीएनए के लिए समाप्त होता है4,5,6,7,8। वैकल्पिक रूप से संयोजक एक गैर में केवल एक डीएनए अंत में शामिल हो सकते है शारीरिक रूप से प्रासंगिक आधा साइट एकीकरण प्रतिक्रिया9,10। जब supercoiled प्लाज्मिड डीएनए एकीकरण का लक्ष्य है, संगठित एकीकरण उत्पादों रैखिक डीएनए और आधा साइट एकीकरण उत्पादों रहे है आराम हलकों । ये प्रतिक्रिया उत्पादों agarose जेल ट्रो1के दौरान उनके रिश्तेदार गतिशीलता द्वारा की पहचान कर रहे हैं । यदि संयोजक में एक दूषित nuclease है, वहां नकली आराम हलकों या संभवतः एक रैखिक प्लाज्मिड प्रयोगात्मक परिणाम भ्रमित होगा । वायरल डीएनए oligomers फ्लोरोसेंट के लिए निर्णायक एकीकरण उत्पादों की पहचान करने के लिए, के रूप में nuclease उत्पादों का विरोध लेबल हो सकता है । हालांकि, में बहुत supercoiled डीएनए लक्ष्य एहसान; supercoiled प्लाज्मिड के किसी भी हानि nuclease दूषित द्वारा हलकों या रैखिक डीएनए आराम करने के लिए परिणाम और डेटा की व्याख्या विषम सकता है11। इस प्रकार तैयारियों में सिंड्रम से जीवाणु nucleases को दूर करना अनिवार्य है.
PFV में बैक्टीरियल nuclease1की तुलना में हेपरिन sepharose के लिए एक अलग समानता है । PFV में और nuclease हेपरिन sepharose से एक रैखिक ढाल रेफरेंस से अलग हो सकता है । nuclease २८० एनएम चोटी पर या विश्लेषणात्मक सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) द्वारा एक पराबैंगनी (यूवी) अवशोषक द्वारा आसानी से पता नहीं है । इसके बजाय, nuclease एक nuclease गतिविधि परख एक supercoiled प्लाज्मिड के रूपांतरण को रोजगार से पता चला है हलकों या रैखिक उत्पादों आराम । प्रत्येक अंश म् हेपरिन sepharose क्रोमैटोग्राफी nuclease गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है । PFV और nuclease contaminant में मोनो-क्यू आयनों राल के लिए अपनत्व में कोई अंतर नहीं है. मोनो एस कटियन राल के लिए संबध में एक छोटे से अंतर है. हालांकि, मोनो-एस में बैक्टीरियल nuclease और PFV के संकल्प प्रोटीन की कुशल जुदाई की अनुमति नहीं होगी । अंततः, हेपरिन sepharose संबध शुद्धि में PFV से बैक्टीरियल nuclease का सबसे अच्छा जुदाई प्रदान करता है और असीमित लोड मात्रा का लाभ है ।
nuclease गतिविधि को दूषित करने के लिए परीक्षण अंय प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ब्याज की प्रोटीन की संभावना में PFV से वैकल्पिक संबंध विशेषताओं होगा; ब्याज और nuclease contaminant के प्रोटीन की बाध्यकारी विशेषताओं में अंतर empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । nuclease संदूषण की पहचान के लिए यह पद्धति मोनो-एस कटियन या मोनो-क्यू आयनों एक्सचेंज रेजिन सहित अन्य रेजिन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । समानता और आयन एक्सचेंज रेजिन क्रोमैटोग्राफी के दौरान प्रोटीन की मात्रा पर कोई सीमा के साथ nucleases दूषित से ब्याज की एक संयोजक प्रोटीन को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए के साथ बातचीत संयोजक प्रोटीन कि डीएनए की मरंमत प्रोटीन के रूप में, एकल अणु माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए ऑक्सीजन मेहतर, या सिंड्रम integrases, जीवाणु nucleases2,3दूषित से मुक्त होना च?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIH AI099854 और AI126742 कुंजी को समर्थन किया गया था ।
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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