Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase
Summary
Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.
Abstract
A proteína integrase (IN) do vírus espumoso da retrovírus protótipo (PFV) é uma enzima de modelo para o estudo do mecanismo de integração retroviral. Comparado a pol de outros retrovírus, PFV IN é mais solúvel e mais receptivos a manipulação experimental. Além disso, é sensível a inibidores de IN clinicamente relevantes vírus de imunodeficiência humana (HIV-1), sugerindo que o mecanismo catalítico da PFV IN é semelhante do HIV-1 IN. IN catalisa juntarem covalente viral DNA complementar (cDNA) para o alvo DNA em um processo chamado transferência de vertente. Esta reação de transferência de vertente apresenta cortes de ADN do alvo. Análise dos produtos de reacção de integração pode ser confundida pela presença de nucleases que nick da mesma forma o DNA. Uma nuclease bacteriana foi mostrado para purificar co com PFV recombinante expressa em Escherichia coli (e. coli). Aqui nós descrevemos um método para isolar PFV IN das nucleases contaminantes por cromatografia de afinidade de heparina. Frações são facilmente rastreadas por contaminação de nuclease com um plasmídeo supercoiled e eletroforese em gel de agarose. PFV IN e o contaminante nuclease exibem afinidades alternativas para heparina sepharose permitindo uma preparação livre de nuclease da recombinação PFV IN adequado para análise de bioquímica ou única molécula em massa de integração.
Introduction
Estudos bioquímicos e única molécula de interações da proteína com DNA requerem proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminar as nucleases de bactérias pode obscurecer os resultados desses ensaios. Um contaminante nuclease foi encontrado em preparações à base de proteínas recombinantes oxigênio ao tesouro protocatechuate-3,4-dioxigenase (PCD) e protótipo vírus espumoso (PFV) integrase (IN) isolados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensaios de integração retroviral dependem a conversão de DNA supercoiled produtos entalhadas ou lineares como uma medida da atividade4. Durante a infecção celular IN junta-se as duas extremidades do cDNA viral para o anfitrião cromatina5. Cada participante se juntar a reação é denominado transferência de vertente. Ensaios de recombinação na atividade posso juntar dois oligómeros de DNA imitar o cDNA viral termina para um destino de DNA em uma integração concertada reação4,5,6,7,8. Alternativamente IN recombinante pode aderir apenas um final de DNA em um site não-fisiologicamente relevante metade integração reação9,10. Quando supercoiled Plasmídeo é alvo de integração, integração concertada produtos são linearizadas DNA e produtos de integração local metade são círculos relaxados. Estes produtos de reação são identificados por sua mobilidade relativa durante de eletroforese de gel de agarose1. Se o recombinante em tem uma contaminante nuclease, haverá círculos relaxados espúrios ou um plasmídeo linear possivelmente confundir os resultados experimentais. Oligómeros de DNA virais podem ser rotulados fluorescente para identificar conclusivamente produtos de integração, ao contrário de produtos da nuclease. No entanto, em muito favorece supercoiled alvos do DNA; qualquer perda do plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou DNA linear por nucleases contaminantes poderia distorcer os resultados e interpretação de dados11. Assim, é imperativo para remover bacterianas nucleases de retroviral em preparações.
PFV em tem uma diferente afinidade para heparina sepharose comparado ao de nuclease bacteriana1. PFV IN e a nuclease podem estar separadas por uma eluição gradiente linear de heparina-sepharose. A nuclease não é facilmente detectado por uma absorvância (UV) ultravioleta no pico de nm 280 ou por eletroforese em gel de poliacrilamida analítica de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Em vez disso, a nuclease é detectado por um ensaio de atividade nuclease empregando a conversão de um plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou produtos lineares. Cada fração após cromatografia de sepharose heparina é testada para a atividade de nuclease. PFV IN e a contaminação de nuclease não tem nenhuma diferença na afinidade para resina de ânion Mono-Q. Há uma pequena diferença na afinidade para resina de cátion Mono-S. No entanto, a resolução de Mono-S de nuclease bacteriana e em PFV não permitiria eficiente separação das proteínas. Em última análise, purificação da afinidade de sepharose heparina oferece a melhor separação de nuclease bacteriana de PFV IN… e tem a vantagem do volume de carga ilimitada.
Teste para contaminar a atividade de nuclease pode ser adaptada a outras proteínas. A proteína de interesse provavelmente terá características de afinidade alternativos que PFV IN; a diferença de vinculação características da proteína de interesse e a contaminação de nuclease deve ser determinada empiricamente. Esta metodologia para identificar contaminação nuclease pode ser adaptada para outras resinas incluindo cátion Mono-S ou resinas de troca de ânion Mono-Q. Afinidade e troca iônica resinas podem oferecer um método confiável para isolar uma proteína recombinante do interesse de contaminar nucleases sem limites no volume de proteína durante a cromatografia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteínas recombinantes que interagem com o DNA, tais como proteínas, catadores de oxigênio para aplicações de microscopia única molécula ou integrases retroviral, de reparação do DNA devem ser livres de contaminação bacteriana nucleases2,3. Estes contaminantes podem confundir a interpretação dos resultados durante os ensaios bioquímicos ou única molécula de granel.
Achamos que uma nuclease bacteriana frequentemente co …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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