JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56675
, , , ,
1Department of Biology,James Madison University

Summary

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Abstract

Cel-autonome neuronale functies van genen kunnen worden onthuld door het veroorzaken van verlies of winst van de functie van een gen in een kleine en spaarzame bevolking van neuronen. Vereist voor het genereren van een mozaïek waarin neuronen met verlies of winst voor de functie van een gen zijn omringd door genetisch onverstoorbaar weefsel om dit te doen. Hier combineren we het Cre-lox recombinatie systeem met in utero electroporation om te genereren van mozaïek hersenweefsel die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de cel-zelfstandige functie van genen in neuronen. DNA constructies (beschikbaar via repositories), codering voor een fluorescerende label en Cre recombinase, worden ingevoerd in de ontwikkeling van de corticale neuronen met genen geflankeerd met loxP sites in de hersenen van muis embryo’s met behulp van in utero Electroporation. Daarnaast beschrijven we verschillende aanpassingen aan de in utero electroporation methode waardoor overlevingsvermogen en reproduceerbaarheid. Deze methode omvat ook tot oprichting van een titer voor Cre-gemedieerde recombinatie bij een schaars of dichte bevolking van neuronen. Histologische preparaten van gelabelde hersenweefsel vereisen geen (maar kan worden aangepast aan) immunohistochemistry. De constructies gebruikt garanderen dat label fluorescently neuronen dragen het gen voor Cre recombinase. Histologische preparaten toestaan morfologische analyse van neuronen via confocal beeldvorming van dendritische en axonale arbors en dendritische spines. Omdat verlies of winst van functie in sparse mozaïek weefsel wordt bereikt, wordt deze methode kunnen de studie van cel-autonome noodzaak en de toereikendheid van gene producten in vivo.

Introduction

Het genereren van een genetische mozaïek is een klassieke experimentele paradigma voor het begrijpen van de functie van een gen van belang. Om te bepalen als een gen noodzakelijk voor een cellulaire fenotype is, wordt de eenvoudigste aanpak veroorzaakt door een verlies van functie van het gen in het organisme (bijvoorbeeld knock-out). Om te bepalen als een gen specifiek in een bepaalde celtype vereist is, is knock-out van het gen in het organisme echter niet een geldige benadering. In plaats daarvan een methode is verplicht die zal leiden tot het verlies van functie van een gen in een bepaalde cel terwijl het wordt omringd door wildtype (dat wil zeggen genetisch onverstoorbaar) weefsel — met andere woorden, het maken van mozaïek weefsel. Als de gemuteerde cel een mutant fenotype toont, maar omringende wildtype cellen niet, de functies van het gen in een cel-autonome wijze. Analyse van mozaïek weefsel, waarin mutantcellen zijn omringd door wildtype weefsel, is ideaal voor het begrijpen van de cel-autonome functies van genen, met name in de hersenen waar neuronen en glia een uitgebreid, onderling verbonden netwerk van weefsel vormen.

Verschillende vormen van mozaïek hersenweefsel hebben verstrekt krachtige modellen om te onderzoeken van cel-autonome functies van genen. Studies gericht op neuronale transplantatie1, vrouwelijke X-gebonden mozaïcisme2,3,4, en endogene somatische mozaïcisme5,6 hun conclusies op basis van mozaïek hebben getrokken hersenweefsel. Voorwaardelijke schrapping van een gen door middel van de Cre-lox recombinatie systeem is een methode die volledig gebruik van de grote beschikbaarheid van transgene muis lijnen maakt. Bij deze methode worden twee loxP sites geïntroduceerd aan weerszijden van een vereiste sequentie van een gen (zoals een exon), waarbij het geflankeerd door loxP sites dat beide in dezelfde richting (“floxed”) worden geconfronteerd. CRE recombinase excises de volgorde tussen de sites loxP7. CRE-gemedieerde recombinatie kan worden bereikt door Overstekende floxed muizen naar een andere muis lijn uiting van Cre recombinase samen met een fluorescerende marker in een subset van cellen (“Cre verslaggever lijn”). Dit is aangetoond in een verscheidenheid van manieren om de functies van een gen in subsets van cellen, zoals de excitatory neuronen of astrocyten8bloot te leggen. CRE verslaggever lijnen kunnen uitdrukken CreERT2 zodat Cre-gemedieerde recombinatie als drug-afleidbare (single-neuron labelen met afleidbare Cre-gemedieerde knockout of SLICK)9. In een andere strategie genaamd mozaïek analyse met dubbele markeringen (MADM)10,11, laat Cre-gemedieerde interchromosomal recombinatie een homozygoot mutant naast heterozygoot weefsel worden gemaakt. In deze benaderingen moet een nieuwe lijn van muizen worden geproduceerd elke keer voor elke kandidaat-gen of cellulaire subtype dat wordt getest. Als alternatief, Cre recombinase kan worden ingevoerd postnatale stadium manifesteren door middel van Iontoforese12 of via virale vectoren (b.v. virussen adeno-geassocieerde13 of lentivirussen14 cellulaire subtype-specifieke uitvoering initiatiefnemers). Deze strategie maakt sterke en postnatale labeling. Te richten op ontwikkeling van cerebrale corticale neuronen dunbevolkte en geïnduceerd, is een ideale strategie in utero electroporation van Cre recombinase met een fluorescerende marker.

Naast het combineren van Cre-lox recombinatie door in utero electroporation te produceren mosaic weefsel in vivo, we verscheidene aanpassingen kennismaken met procedures van andere gepubliceerde protocollen15,16, 17,18,19,20,21. Wij bieden informatie om succes in de getimede-zwangere vrouwelijke fokdieren. Wij ook een overzicht van onze twee strategieën in te voeren schaars en heldere labeling van neuronen in de corticale weefsel: een strategie is om de niveaus van een enkele construct codering voor Cre recombinase en een fluorescerende marker22Titreer. Een andere strategie is het gebruik van de “Supernova”-systeem, ontworpen specifiek met deze parameters in gedachten23,24. Daarnaast bieden wij verbeteringen op het produceren van consistente microinjection pipetten en vereenvoudigingen van de in utero electroporation operatie. Tot slot schetsen we kritische stappen in een vereenvoudigde histologisch preparaat dat de analyse van dendritische spines en dendritische en axonale arbors, zonder verdere kleuring of immunohistochemistry toelaat.

Protocol

Methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van James Madison University, en zijn overeenkomstig en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren. 1. muis Set-up Huis van een jonge (> P60) mannelijke en vrouwelijke homozygoot floxed muis samen aan het opzetten van een kweker paar25.Opmerking: Een goede negatieve controle is het opzetten van een paar extra Fokker van wildtype mu…

Representative Results

De single construeren GFP. CRE (Zie materiaallijst) was electroporated op E15.5 en gevisualiseerd op P14. Afhankelijk van de concentratie van de constructie en de omvang van de injectie, kan een schaars of dichte resultaat worden verkregen van22,26. Bijvoorbeeld injectie van 1 µL van 2 mg/mL GFP. De resultaten van het CRE in een verspreide verdeling van gelabelde cellen, waarvan sommige helder (figuur 1A</str…

Discussion

Hier introduceren we de combinatie van in utero electroporation met Cre recombinase bij floxed muizen voor het genereren van mozaïek hersenweefsel. Een voordeel van deze aanpak is dat een nieuwe lijn van de muis niet hoeft te worden gegenereerd elke keer een verschillende cellulaire subtype is gericht: in utero electroporation kan worden gebruikt om te richten excitatory neuronen, remmende neuronen of glia afhankelijk van de tijd en de locatie van electroporation15,<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken de gulle steun van het James Madison University Department of Biology, James Madison Universiteit licht microscopie en de Imaging faciliteit. Dr. Mark L. Gabriele voor nuttig advies met betrekking tot jonge postnatale weefsel voorbereiding, en Drs. Justin W. Brown en Corey L. Cleland voor gulle coördinatie van chirurgische materialen en ruimte. Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door een gezamenlijke onderzoeksbeurs door 4-VA, een samenwerkingspartnerschap ter bevordering van de Commonwealth van Virginia (G.S.V.), en door een Virginia Academie van Science kleine onderzoek projectsubsidie (G.S.V.). Ondersteuning is royaal voorzien door een Betty Jo liefdevolle Butler ‘ 58 Endowment Undergraduate Research beurs (aan K.M.B.), een Farrell zomer onderzoek beurs (voor K.M.B.), een James Madison universiteit tweede eeuw beurs (voor K.M.B.), een James Madison Universiteit Centennial beurs (voor C.J.H.), een James Madison Universiteit Lucy Robinson Search ‘ 30 Memorial Scholarship (aan Z.L.H.) en een James Madison Hogeschool voor wetenschap en wiskunde de toekenning van de bijstand van de faculteit (aan G.S.V.).

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. . . Plasmids 101: A Desktop Resource. , (2017).
  31. . . Pipette Cookbook. , (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
  33. Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).

Tags

Cre-lox RecombinationMouse Cerebral CortexIn Utero ElectroporationGenetic MosaicNeurobiologyLayer 2-3 Cortical NeuronsPipette PreparationEmbryonic Day 15.5AnesthesiaMouse Surgery
check_url/56675?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image