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Abstract
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Neuroscience

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56675
, , , ,
1Department of Biology,James Madison University

Summary

Cellule autonome fonction des gènes dans le cerveau peut être étudiées en induisant la perte ou gain de fonction dans des populations clairsemées de cellules. Nous décrivons ici dans l’utérus l’électroporation pour livrer une recombinase Cre en populations clairsemées de mettre au point des neurones corticaux avec floxed gènes à provoquer une perte de fonction in vivo.

Abstract

Les fonctions neuronales cellule autonome de gènes peuvent être révélées par une perte ou gain de fonction d’un gène dans une petite population clairsemée des neurones. Pour ce faire nécessite générant une mosaïque dans laquelle des neurones avec perte ou gain de fonction d’un gène sont entourés de tissu génétiquement non perturbé. Ici, nous combinons le système de recombinaison Cre-lox avec in utero électroporation afin de générer des tissus cérébraux de mosaïque qui peuvent être utilisé pour étudier la fonction cellule autonome de gènes dans les neurones. Constructions d’ADN (disponible par le biais de dépôts), codant pour une étiquette fluorescent et la recombinase Cre, sont introduits dans le développement des neurones corticaux contenant des gènes flanqués de sites loxP dans le cerveau d’embryons de souris à l’aide de in utero électroporation. En outre, les auteurs décrivent les diverses adaptations de la méthode d’électroporation in utero qui augmentent les chances de survie et de la reproductibilité. Cette méthode consiste aussi à établir un titre pour la recombinaison Cre-mediated dans une population clairsemée ou dense des neurones. Préparations histologiques du tissu cérébral marqués n’ont pas besoin (mais peut être adaptées à) l’immunohistochimie. Les constructions utilisées garantissent que fluorescent étiqueté neurones portent le gène de la recombinase Cre. Préparations histologiques permettent une analyse morphologique des neurones par le biais de l’imagerie confocale des arbres dendritiques et axonales et des épines dendritiques. Parce que perte ou gain de fonction est fournie dans les tissus de mosaïque éparse, cette méthode permet l’étude des cellules autonomes nécessité et la suffisance des produits de gène in vivo.

Introduction

Générant une mosaïque génétique est un paradigme expérimental classique pour comprendre la fonction d’un gène d’intérêt. Pour déterminer si un gène est nécessaire pour un phénotype cellulaire, l’approche la plus simple est à l’origine une perte de fonction du gène dans l’ensemble de l’organisme (p. ex. knockout). Toutefois, pour déterminer si un gène est nécessaire précisément dans un certain type de cellule, Knock-out du gène dans l’ensemble de l’organisme n’est pas une approche valable. Au lieu de cela, il faut une méthode qui causera la perte de fonction d’un gène dans une cellule donnée alors qu’il est entouré par le tissu de type sauvage (c’est-à-dire génétiquement non perturbé) — en d’autres termes, création de tissus de mosaïque. Si la cellule mutante montre un phénotype mutant, mais les cellules environnantes de type sauvage n’est pas la fonction des gènes de manière autonome-cellule. Analyse du tissu de mosaïque, dans lequel les cellules mutantes sont entourés de tissu de type sauvage, est idéal pour comprendre les fonctions cellulaires-autonome des gènes, en particulier dans le cerveau où les neurones et cellules gliales forment un vaste réseau interconnecté de tissu.

Plusieurs formes de tissus cérébraux de mosaïque ont fourni des modèles puissants pour étudier les fonctions cellulaires-autonome des gènes. Études axées sur la transplantation de neurones1, femelle mosaïcisme liée à le X2,3,4, et le mosaïsme somatique endogène5,6 ont tiré leurs conclusions fondées sur la mosaïque tissu cérébral. Suppression conditionnelle d’un gène par le système de recombinaison Cre-lox est une méthode qui tire pleinement parti de la grande disponibilité des lignées de souris transgéniques. Dans cette méthode, deux sites loxP sont mis en ligne sur chaque côté d’une séquence requise d’un gène (par exemple un exon), laissant flanqué de sites loxP que tous deux faire face dans la même direction (« floxed »). Recombinase cre accises la séquence entre les sites de loxP7. Recombinaison CRE-négociée est possible en traversant floxed souris à une autre lignée de souris exprimant la recombinase Cre avec un marqueur fluorescent dans un sous-ensemble de cellules (« ligne de journaliste Cre »). Cela a été démontré dans une variété de façons de découvrir les fonctions d’un gène dans des sous-ensembles de cellules, telles que des neurones excitateurs ou astrocytes8. Lignes de journaliste cre peuvent exprimer CreERT2 pour permettre la recombinaison Cre-mediated être induit par drogue (single-neurone marquage avec masquage de Cre-mediated inductible ou SLICK)9. Dans une autre stratégie appelée analyse de mosaïque avec double marqueurs (MADM)10,11, induite par le Cre interchromosomique recombinaison permet un homozygote mutant à créer aux côtés de tissu hétérozygote. Dans ces approches, une nouvelle gamme de souris doit être produite chaque fois pour chaque gène candidat ou sous-type cellulaire qui est testé. Alternativement, une recombinase Cre peut être introduite après la naissance par iontophorèse12 ou par l’intermédiaire de vecteurs viraux (p. ex. virus adéno-associés13 ou lentivirus14 transportant sous-type cellulaire spécifique promoteurs). Cette stratégie crée fort et postnatale d’étiquetage. Pour cibler le développement des neurones du cortex cérébral faiblement et avant la naissance, une stratégie idéale est dans l’utérus l’électroporation de recombinase Cre avec un marqueur fluorescent.

En plus de combiner la recombinaison Cre-lox à travers dans l’utérus l’électroporation pour produire mosaïque tissu in vivo, nous introduisons plusieurs adaptations aux procédures des autres protocoles publiés15,16, 17,18,19,20,21. Nous fournir des informations pour améliorer la réussite dans les enceintes chronométré femelles reproductrices. Nous exposons également nos deux stratégies pour introduire clairsemée et lumineux, marquage des neurones dans les tissus corticaux : une stratégie consiste à titrer les niveaux d’une construction unique codant pour la recombinase Cre et un marqueur fluorescent22. Une autre stratégie consiste à utiliser le système de « Supernova », conçu spécifiquement pour ces paramètres en compte23,24. En outre, nous offrons des améliorations sur la production de pipettes de micro-injection cohérente et des simplifications à la chirurgie d’électroporation in utero . Enfin, nous décrivons les étapes critiques dans une préparation histologique simplifiée qui permet l’analyse des épines dendritiques et arbres dendritiques et axonales, sans autre coloration ou immunohistochimie.

Protocol

Méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation Comité (ACUC) de James Madison University et animalier et sont en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels. 1. Configuration de la souris Accueillir un jeune (> P60) souris mâles et femelles floxed homozygotes ensemble pour mettre en place un éleveur paire25.Remarque : Un bon contrôle négatif est de mettre en place une paire supplémentaire ?…

Representative Results

La construction unique de GFP. CRE (voir la liste des matériaux) a été électroporés à E15.5 et visualisé à P14. Selon la concentration de la construction et le volume d’injection, un résultat dense ou clairsemé, peut être obtenu22,26. Par exemple, l’injection de 1 µL de 2 mg/mL GFP. Résultats de cre une distribution clairsemée des cellules marquées, dont certaines peuvent être vives (Figure…

Discussion

Ici, nous introduisons la combinaisondes in utero électroporation avec recombinase Cre chez la souris floxed pour générer des tissus cérébraux de mosaïque. Un avantage de cette approche est qu’une nouvelle ligne de souris n’a pas besoin d’être générés chaque fois qu’un autre sous-type cellulaire est d’être la cible : in utero électroporation permet de cibler des neurones excitateurs, neurones inhibiteurs ou cellules gliales selon la période et l’emplacement de l’électroporat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le généreux soutien du département de biologie de l’Université James Madison et James Madison University lumière microscopie Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele pour obtenir des conseils utiles au sujet de la préparation de jeunes tissus postnatal, et Drs Justin W. Brown et Corey L. Cleland de coordination généreux d’espace et de matériel chirurgical. Cette recherche a été financée en partie par une subvention de recherche concertée par 4-VA, un partenariat de collaboration pour faire progresser le Commonwealth de la Virginie (G.S.V.) et par une Virginie Académie des Science petit projet subvention de recherche (G.S.V.). Appui a été généreusement fourni par une dotation de Betty Jo Butler aimante 58 pour la bourse de recherche de premier cycle (à K.M.B.), une bourse de recherche de l’été de Farrell (pour K.M.B.), une bourse de siècle deuxième James Madison University (pour K.M.B.), un James Madison University bourses du centenaire (à C.J.H.), un James Madison University recherche 30 Lucy Robinson Memorial Scholarship (à Z.L.H.) et un James Madison University College of Science et de la bourse d’aide Faculté de mathématiques (à G.S.V.).

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")
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References

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