مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات
Summary
تفاصيل هذه المخطوطة مقايسة دوت مباشرة وصمة عار كوانتيتيشن من التتر الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) وتطبيقه على دراسة دور الجمعية-تفعيل البروتينات (آبس)، فئة جديدة من البروتينات الفيروسية غير الهيكلية الموجودة في جميع إف اللقاح، في الترويج لجمعية كابسيدس المستمدة من اللقاح إف المشابهة ومغايرة.
Abstract
بينما الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) مقبول على نطاق واسع متجه جذابة للعلاج الجيني، أيضا بمثابة فيروس نموذجي لفهم البيولوجيا الفيروس. وفي الصدد، الاكتشاف الأخير للبروتين إف غير هيكلية، ووصف الجمعية-تفعيل البروتين (AAP)، ضوءا جديداً على العمليات التي ينطوي عليها جمعية البروتينات الفيروسية قفيصه نائب الرئيس إلى قفيصه. على الرغم من أن العديد من إف اللقاح يتطلب الوكالة الأسترالية للجمعية، أننا قد ذكرت مؤخرا أن AAV4، 5، و 11 استثناءات لهذه القاعدة. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن آبس وكابسيدس المجمعة من اللقاح مختلفة المعربة إلى مقصورات سوبسيلولار مختلفة. هذا التباين غير متوقعة في الخصائص البيولوجية والأدوار الوظيفية من آبس بين مختلف إف اللقاح يؤكد أهمية الدراسات في AAPs المستمدة من اللقاح المتنوعة. تفاصيل هذه المخطوطة مقايسة دوت مباشرة وصمة عار كوانتيتيشن إف وتطبيقه على تقييم الوكالة الأسترالية خصوصية الاتكال والنمط المصلي المسيطر في الجمعية قفيصه. وللتدليل على فائدة هذه المقايسة دوت وصمة عار، حددنا لتميز الجمعية قفيصه وتبعية الوكالة الأسترالية “إف ثعبان” وزواحف سابقا أونتشاراكتيريزيد إف، فضلا عن AAV5 و AAV9، التي ثبت سابقا أن تكون مستقلة عن الوكالة الأسترالية، وتعتمد على الوكالة الأسترالية اللقاح، على التوالي. المقايسة كشفت عن أن الجمعية قفيصه “إف ثعبان” يتطلب “الوكالة الأسترالية ثعبان” ولا يمكن تعزيزها آبس من AAV5 و AAV9. كما أظهرت المقايسة، خلافا للعديد من النمط المصلي المسيطر المشتركة آبس التي تعزز الجمعية قفيصه مغايرة بالتكامل عبر، “الوكالة الأسترالية الأفعى” لا تشجع جمعية كابسيدس AAV9. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يؤثر اختيار نوكلاس كثيرا على قراءات للمقايسة وصمة عار دوت، وهكذا، اختيار إنزيم أمثل أمر حاسم لتقييم نجاح التتر إف.
Introduction
الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) فيروس الحمض النووي الصغيرة، غير المغلفة، واحد-الذين تقطعت بهم السبل مع جينوم لحوالي 4.7 كيلوبس (kb). جينوم إف يحتوي على إطارات مفتوحة القراءة (Orf) للجينات مندوب و كاب . في عام 2010، اكتشفت أم سونتاج et al. بروتين nonstructural سابقا مجهولة مرمزة بواسطة ORF تحول الإطار + 1 داخل الجينات كاب AAV2 ووجدت أن تلعب دوراً حاسما في جمعية AAV2 قفيصه نائب الرئيس مونومر البروتينات في الفيروسية 1من قفيصه. قد سمي هذا البروتين رواية الجمعية-تفعيل البروتين (AAP) بعد الدور الذي تؤديه في تعزيز قفيصه الجمعية العامة1.
وقد ORFs للوكالة الأسترالية بيوينفورماتيكالي التي تم تحديدها في الجينوم من جميع بارفوفيروسيس داخل جنس ديبيندوبارفوفيروس، ولكن ليس ضمن مورثات من فيروسات أجناس مختلفة من الأسرة1،البارفو2. الدراسات الفنية لهذا البروتين الرواية في البداية ركزت على الوكالة الأسترالية من النموذج AAV2 (AAP2)، التي أنشأت بالدور الأساسي ل AAP2 في استهداف البروتينات نائب الرئيس مفككة إلى نوية لتراكم وتكوين في كامل تجميع كابسيدس1،،من34. وقد عجز كابسيدس AAV2 التجمع في غياب التعبير الوكالة الأسترالية بشكل مستقل أكدت مجموعات متعددة، بما في ذلك بلدنا1،2،،من34،5 . الدراسات اللاحقة على اللقاح إف 1 و 8 و 9 يؤكد على الدور الحاسم آبس في الجمعية قفيصه، كالبروتينات مونومر VP3 من AAV1، 8، و 9 لم يتمكنوا من تشكيل من قفيصه مجمع بشكل كامل في غياب التعبير المشارك من الوكالة الأسترالية2.
في الآونة الأخيرة، من خلال النهج التي تشمل استخدام الكمية دوت لطخة فحوصات، نحن التحقيق في قدرة AAV1 على 12 VP3 مونومرات لتجميع إلى كابسيدس في غياب التعبير الوكالة الأسترالية، وقدرة AAP1 إلى 12 النهوض بجمعية مونومرات VP3 من اللقاح مغايرة. وقد كشفت هذه الدراسة أن AAV4، VP3 5، و 11، يمكن تجميع مونومرات دون الوكالة الأسترالية. بالإضافة إلى ذلك، قد تبين أن ثمانية من أصل اللقاح الوكالة الأسترالية اثنا عشر قمنا بفحص (أي، لكن كل AAP4، 5 و 11 و 12) عرض بقدرة واسعة لدعم الجمعية قفيصه من كابسيدس النمط المصلي المسيطر إف مغايرة، بينما AAP4، 5 و 11 و 12 عرض إلى حد كبير قدرة محدودة في هذا الصدد6. هذه الأنماط الأربعة فيلوجينيتيكالي بعيدة عن الآخر الوكالة الأسترالية اللقاح2،3. وعلاوة على ذلك، كشفت الدراسة تغايرية مهمة في تعريب سوبسيلولار مختلفة آبس6. وعلاوة على ذلك، وقد اقترحت الدراسة أن الرابطة ضيق من الوكالة الأسترالية مع كابسيدس المجمعة ونويه، السمة المميزة للجمعية قفيصه AAV2، بالضرورة لا يمكن أن تمتد للقاح الأخرى بما في ذلك AAV5، 8، و 9، الذي عرض استبعاد النوية كابسيدس المجمعة6. وبالتالي، المعلومات المكتسبة من دراسة أي النمط المصلي المسيطر خاصة الوكالة الأسترالية ليس نطاق واسع ينطبق على جميع الأحياء الوكالة الأسترالية. ويؤكد هذا الطابع المحير البيولوجيا الوكالة الأسترالية الحاجة إلى التحقيق في دور ووظيفة كل الوكالة الأسترالية من اللقاح إف كل المقبول وغير المقبول.
يمكن تقييم دور الوكالة الأسترالية البيولوجية في قفيصه الجمعية بتحديد التتر الجسيمات الفيروسية إف مغلفة تماما تنتج الكلي الجنينية البشرية (HEK) الخلايا 293، خط الخلية الأكثر استخداماً لإنتاج ناقلات إف، مع أو بدون البروتين الوكالة الأسترالية التعبير. هي الأساليب القياسية كوانتيتيشن إف PCR الكمي (qPCR)-استناداً إلى فحوصات7،8 ودوت الكمية على أساس وصمة عار فحوصات9. طرق أخرى إف كوانتيتيشن الجسيمات الفيروسية مثل المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم10،11 أو الكثافة الضوئية قياس12 ليست مثالية للعينات المستمدة من العديد من اللقاح إف مختلفة أو العينات ملوثة بالشوائب (ليساتيس النفط الخام أو ثقافة وسائل الإعلام)، التي غالباً ما تكون العينات المستخدمة للبحوث إف. حاليا، قبكر هو الأكثر استخداماً كوانتيتاتيون إف؛ ومع ذلك، من الضروري أن نعترف بالمحاذير المحتملة من مقايسة المستندة إلى قبكر، كما الفحص يمكن أن تؤدي الأخطاء النظامية وعيار كبير الاختلافات13،14. فحوصات على أساس PCR تتأثر بعدد من عوامل، مثل وجود دبابيس الشعر الطرفية تساهمي مغلقة في قوالب PCR التي تمنع التضخيم13التباس يحتمل أن تكون. حتى فرد ذوي خبرة يمكن أن يعرض إمكانات عوامل التباس في أساس qPCR الاعتداء تدري13. وفي المقابل، فحوصات وصمة عار دوت الكمية هي تقنية بيولوجيا الجزيئية كلاسيكية التي لا تنطوي على التضخيم الجينوم ويستخدم مبدأ أبسط بكثير مع الحد أدنى من مخاطر للأخطاء بالمقارنة مع الاختبارات المستندة إلى قبكر. الأسلوب أقل صعوبة من الناحية التقنية؛ ولذلك، نتائج التحليل يتم استنساخه بشكل معقول حتى من قبل الأفراد عديمي الخبرة.
في هذا التقرير، يصف لنا تفاصيل مقايسة وصمة عار دوت كمية نستخدمها بشكل روتيني لناقل إف كوانتيتيشن وتوفير مثال عن كيفية تطبيق التحليل دراسة دور تعزيز الجمعية آبس في عام اللقاح (AAV5 و AAV9)، والمنهجية أونتشاراكتيريزيد AAP سابقا من “ثعبان إف”14. في الطبيعة، يعبر عن “نائب الرئيس إف” البروتينات والبروتينات الوكالة الأسترالية في رابطة الدول المستقلة من جينة واحدة (أي، الوكالة الأسترالية نائب رئيس رابطة الدول المستقلة-التكامل)، بينما في مقايسة الموصوفة هنا، يتم توفير البروتينات نائب الرئيس والوكالة الأسترالية في ترانس من اثنين والبلازميدات منفصلة (أي، نائب الرئيس–الوكالة الأسترالية ترانس-التكامل). حيث يمكن التعبير عن كل البروتين نائب الرئيس أو الوكالة الأسترالية من اللقاح مختلفة من كل بلازميد مستقلة، يصبح من الممكن لاختبار تركيبات نائب الرئيس-الوكالة الأسترالية مغايرة للجمعية قفيصه (أي، نائب الرئيس–الوكالة الأسترالية عبر-التكامل). بإيجاز، VP3 إف من اللقاح مختلف أعرب عن في الخلايا HEK 293 تعداء بلازميد الحمض النووي حزمة جينوم ناقل إف في وجود أو غياب النمط المصلي المسيطر المشابهة الوكالة الأسترالية، أو حضور النمط المصلي المسيطر مغايرة الوكالة الأسترالية. وبعد الإنتاج، وسائط الثقافة وخلية ليساتيس يتعرضون مقايسة دوت وصمة عار التحديد الكمي للجينوم الفيروسي داخل shell قفيصه. الخطوة الأولى للمقايسة وصمة عار دوت التعامل مع عينات مع نوكلاس لإزالة تلويث بلازميد السلطات الوطنية المعينة وغير معبأة إف الجينوم في العينات. أن الفشل في القيام بذلك زيادة الإشارات الخلفية خاصة عندما يتم جزيئي عينات أونبوريفيد. ويعقب هذا ثم علاج مبطلات لكسر كابسيدس الفيروسية والإفراج عن الجينوم الفيروسي نوكلاس المقاوم في عينة حلول. الجينوم الفيروسية القادم، والتشويه والتحريف ومسح على غشاء وتهجين مع مجس الحمض النووي خاصة جينوم فيروسي كوانتيتيشن. في المقايسة المثال ذكرت هنا، نظهر أن يتطلب VP3 إف ثعبان ثعبان الوكالة الأسترالية للجمعية قفيصه وأن “الوكالة الأسترالية الأفعى” لا يروج لجمعية كابسيدس AAV9 خلافا للعديد من آبس المستمدة من اللقاح تعتمد على الوكالة الأسترالية التي يمكن أيضا أن تعزز الجمعية من كابسيدس النمط المصلي المسيطر مغايرة. أخيرا، نحن تقرير المحاذير هامة إلى قبكر أو فحوصات دوت كوانتيتيشن إف المستندة إلى وصمة عار أن اختيار نوكلاس يؤثر إلى حد كبير على نتائج التحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد في هذا التقرير، الأداة المساعدة لفحوصات وصمة عار دوت الكمية لدراسة “آبس إف” ودورهم في الجمعية قفيصه. يمكن أن توفر المعارف المكتسبة من هذه الدراسات التفصيلية ثاقبة الاختلافات الفطرية عملية الجمعية قفيصه إف ودور AAPs الوظيفية بين الأنماط المختلفة. وفي هذا الصدد، لطخة دوت عبر التكامل إف VP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر شياو شياو في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل لتزويدنا بلازميد بيمبل-CMV-التجارة والنقل. ونشكر كريستوفر تشنغ وصمويل هوانغ جيه لقراءة نقدية من المخطوطة. أيد هذا العمل منح “دائرة الصحة العامة” (المعاهد الوطنية للصحة R01 NS088399 و T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
References
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
