Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas
Summary
Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação da concentração de vírus adeno-associado (AAV) e sua aplicação para estudar o papel da montagem-ativando proteínas (AAPs), uma classe nova de proteínas virais não estruturais encontrados em todos os vírus adeno-associados sorotipos, em promover a montagem de capsids derivado cognatos e heterólogos serótipos AAV.
Abstract
Enquanto o vírus adeno-associado (AAV) é amplamente aceita como um vetor atraente da terapia genética, serve também como um vírus de modelo para entender a biologia do vírus. A último aspecto, a recente descoberta de uma proteína não-estruturais AAV, denominada Assembleia-ativando proteína (AAP), tem lançar luz sobre os processos envolvidos na montagem das proteínas do capsídeo viral VP em um capsídeo. Embora muitos sorotipos de vírus adeno-associados exigem AAP para montagem, temos recentemente relatado que AAV4, 5, e 11 são exceções a essa regra. Além disso, temos demonstrado que AAPs e capsids montados de diferentes sorotipos localizar para diferentes compartimentos subcellular. Esta heterogeneidade inesperada na propriedades biológicas e funções funcionais da AAPs entre AAV diferente sorotipos sublinhados que a importância dos estudos na PittCon derivada de diversos sorotipos. Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação de AAV e sua aplicação para avaliar a especificidade de dependência e sorotipo AAP no assembly do capsídeo. Para demonstrar a utilidade deste teste do borrão de ponto, partimos para caracterizar o conjunto de capsídeo e AAP dependência de AAV cobra, um réptil anteriormente descaracterizado AAV, bem como AAV5 e AAV9, que anteriormente foram mostrados para ser independente de AAP e dependente da AAP sorotipos, respectivamente. O ensaio revelou que o conjunto de capsídeo cobra AAV requer cobra AAP e não pode ser promovido por AAPs de AAV5 e AAV9. O ensaio também mostrou que, ao contrário de muitos o sorotipo comum PittCon que promovem Assembleia capsídeo heteróloga por Cruz-complementação, cobra AAP não promove Assembleia de AAV9 capsids. Além disso, mostramos que a escolha de nuclease afeta significativamente a leitura do ensaio de mancha do ponto, e assim, escolher uma enzima ideal é fundamental para o sucesso avaliação de títulos AAV.
Introduction
Vírus adeno-associado (AAV) é um pequeno, não-envelopado, single-stranded DNA vírus com um genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). O genoma do vírus adeno-associados contém quadros de leitura aberta (ORFs) para os genes rep e cap . Em 2010, uma proteína não-estruturais inédita codificada por um + 1 quadro-deslocados ORF dentro do gene do tampão de AAV2 foi descoberta por Sonntag et al e verificou-se que desempenham um papel fundamental na montagem de AAV2 proteínas do capsídeo VP monômero em um viral capsídeo1. Esta proteína romance foi nomeada assembly-ativando proteína (AAP) após o papel que desempenha na promoção do capsídeo conjunto1.
As ORFs para AAP foram identificado bioinformatically nos genomas dos parvovírus todos do género Dependoparvovirus, mas não dentro os genomas dos vírus de diferentes gêneros dos parvovírus família1,2. Estudos funcionais desta proteína romance foram inicialmente focados no AAP do protótipo AAV2 (AAP2), que estabeleceu o papel essencial da AAP2 no direcionamento de proteínas de VP desmontadas para o nucléolo para sua acumulação e formação em totalmente montados capsids1,3,4. A incapacidade dos capsids AAV2 a montar na ausência de expressão de AAP tem sido independentemente confirmada por vários grupos, incluindo a nossa,1,2,3,4,5 . Estudos posteriores em serótipos AAV 1, 8 e 9 corroborou o papel crítico da AAPs no assembly do capsídeo, como proteínas de monômero VP3 de AAV1, 8, e 9 foram incapazes de formar um capsídeo totalmente montado na ausência de expressão co da AAP2.
Recentemente, através de abordagens que incluem o uso de ponto quantitativo borrão ensaios, investigamos a capacidade de AAV1 de 12 VP3 monômeros para montar em capsids na ausência de expressão de AAP e a capacidade de AAP1 a 12 para promover a montagem de VP3 monômeros de heterólogos serótipos. Este estudo revelou que AAV4, 5 e 11 VP3 monómeros podem montar sem AAP. Além disso, verificou-se que oito dos serótipos AAP doze nós examinamos (isto é, todos, mas AAP4, 5, 11 e 12) exibida uma ampla capacidade de suporte conjunto capsídeo de capsids de sorotipo heterólogos da AAV, enquanto AAP4, 5, 11 e 12 exibido um substancialmente capacidade limitada nesta consideração6. Estes quatro sorotipos são filogeneticamente distantes do outro AAP serótipos2,3. Além disso, o estudo revelou significativa heterogeneidade em suas localizações subcellular de diferentes PittCon6. Além disso, o estudo tem sugerido que a associação apertada da AAP com capsids montados e o nucléolo, a marca da montagem do capsídeo AAV2, necessariamente não pode ser estendida para outros sorotipos incluindo AAV5, 8 e 9, que exibem nucleolar exclusão de capsids montados6. Assim, a informação adquirida com o estudo de qualquer sorotipo específico AAP não é amplamente aplicável para todos biologia AAP. Natureza tão intrigante da biologia AAP enfatiza a necessidade de investigar o papel e a função de cada AAP de canônicos e não-canônicos serótipos AAV.
O papel biológico da AAP no assembly do capsídeo pode ser avaliado, determinando que os títulos de partícula viral de AAV totalmente embalados produziram no rim embrionário humano (HEK) 293 células, a linha de celular mais comumente usados para produção de vetor de vírus adeno-associados, com ou sem proteína AAP expressão. Os métodos padrão para quantificação de AAV são PCR quantitativo (qPCR)-ensaios com base7,8 e dot quantitativo baseado em blot ensaios9. Outros métodos para quantificação de partícula viral AAV como de10,de ensaio enzima-lig da imunoabsorção11 ou de medição de densidade óptica12 não são ideais para amostras provenientes de muitos diferentes sorotipos de vírus adeno-associados ou amostras contaminado com impurezas (lysates bruto ou meios de cultura), que muitas vezes são as amostras utilizadas para pesquisa AAV. Atualmente, qPCR é mais amplamente utilizado para quantificação de vírus adeno-associados; no entanto, é necessário reconhecer potenciais advertências do ensaio qPCR-baseado, como o ensaio podem resultar em erros sistêmicos e título significativas variações13,14. Ensaios baseados em PCR são afetados por uma série de confusão potencialmente fatores, tais como a presença de grampos de cabelo terminais fechados covalentemente em modelos PCR que inibem a amplificação13. Até mesmo um indivíduo experiente pode apresentar potencial fatores de confundimento em uma base qPCR inconscientemente ensaio13. Em contraste, os ensaios de mancha ponto quantitativos são uma técnica clássica de biologia molecular que não envolve a amplificação do genoma e usa um princípio muito mais simples com um risco mínimo de erros em comparação com ensaios baseados em qPCR. O método é menos tecnicamente desafiador; Portanto, os resultados do ensaio são razoavelmente reproduzíveis mesmo por pessoas inexperientes.
Neste relatório, descrevemos os detalhes metodológicos de um ensaio de mancha de ponto quantitativa rotineiramente usamos para quantificação de vetor de vírus adeno-associados e fornecer um exemplo de como aplicar o ensaio para estudar o papel de montagem-promoção da AAPs em comum sorotipos (AAV5 e AAV9) e uma anteriormente descaracterizada AAP de AAV cobra14. Na natureza, AAV VP proteínas e proteínas AAP são expressos em cis de um único gene (ou seja, VP-AAP cis-complementação), enquanto no ensaio descrito aqui, proteínas de VP e AAP são fornecidas em trans de dois plasmídeos separados (ou seja, VP-AAP trans-complementação). Desde que cada proteína VP ou AAP de sorotipos diferentes pode ser expressa de cada independente do plasmídeo, torna-se possível testar combinações de VP-AAP heterólogos para montagem do capsídeo (ou seja, VP-AAP Cruz-complementação). Brevemente, VP3 AAV de vários serótipos é expresso em células HEK 293 transfeccao de Plasmideo DNA de um genoma de vetor de vírus adeno-associados do pacote na presença ou ausência do sorotipo cognato AAP, ou na presença de um sorotipo heterólogo AAP. Após a produção, meios de cultura e lisados celulares são submetidos a um ensaio de mancha de ponto para quantificar o genoma viral dentro do shell do capsídeo. O primeiro passo do ensaio de mancha do ponto é tratar as amostras com uma nuclease para remover contaminantes DNAs plasmideo e genomas AAV não acondicionadas em amostras. A não observância aumentaria os sinais de fundo, em particular quando impuro amostras são doseadas. Esta é seguida por um tratamento de protease para quebrar capsids virais e liberam nuclease resistente genomas virais em soluções de amostra. Genomas virais, próximo são desnaturadas, destruídas em uma membrana e hibridizadas com uma sonda de DNA específico do genoma viral para quantificação. No ensaio exemplo relatado aqui, demonstramos que cobra AAV VP3 exige cobra AAP para montagem do capsídeo e que cobra AAP não promove a montagem de AAV9 capsids ao contrário de muitos as AAPs derivados de serótipos AAP-dependente que podem também promover a montagem de capsids do sorotipo heterólogo. Por último, relatamos uma ressalva importante para qPCR ou quantificação de AAV ponto baseado em blot ensaios que a escolha de nuclease afeta significativamente os resultados do ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório, a utilidade dos ensaios de borrão ponto quantitativa para estudar AAV AAPs e seu papel na montagem do capsídeo é descrita. Conhecimentos adquiridos com estes estudos podem fornecer insights detalhadas sobre as diferenças inatas no processo de montagem de capsídeo do vírus adeno-associados e o papel funcional da AAPs entre diferentes sorotipos. A este respeito, o ponto de cruz-complementação de AAV VP3-AAP blot revelou que cobra AAV VP3 exibido uma dependência estrita a expressão co seu cognato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Xiao Xiao na Universidade de North Carolina em Chapel Hill, por nos oferecer o plasmídeo pEMBL-CMV-GFP. Agradecemos a Christopher Cheng e Samuel J. Huang pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede (NIH R01 NS088399 e EY232113 T32).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
References
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