AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質
Summary
アデノ随伴ウイルス (AAV) 抗体とアセンブリ活性化の役割を研究する応用を定量化するための簡単なドット プロット法の詳細を本稿では蛋白質 (薬学会合同)、すべて AAV が見つかりましたウイルスの非構造タンパク質の新規クラス血清型、同種および異種 AAV の血清型に由来するカプシドのアセンブリを促進します。
Abstract
アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) は遺伝子療法のための魅力的なベクトルとして広く受け入れられて、それはまた、ウイルスの生物学を理解するためのモデル ウイルスとして提供しています。後者の点でアセンブリ活性化タンパク質 (AAP) と呼ばれる非構造 AAV 蛋白質の最近の発見はキャプシドにウイルス キャプシド VP のアセンブリにかかわるプロセスに新たな光を当てます。我々 が最近報告している多くの AAV の血清型には、アセンブリの AAP が必要ですが、その AAV4、5、11 がこの規則の例外を。さらに、薬学会合同と異なる血清型の組み立てのカプシドを別の細胞内コンパートメントにローカライズすることを示した。生物学的特性と異なる AAV 間薬学会合同の機能的役割で予期しないこの不均一性アンダー スコア薬学会合同研究の重要性は多様な血清型に由来の血清型します。この原稿は、AAV の定量とその応用キャプシド アセンブリの AAP 依存性と血清型特異性を評価するために簡単なドット プロット法を詳しく説明します。このドット プロット法の有用性を示すためには、カプシド アセンブリおよび AAP 蛇 AAV, 以前メタボライト爬虫類 AAV と同様、AAV5 および AAV9、AAP 自立・ AAP 依存以前示されている依存性を特徴付けるに着手しました血清型、それぞれ。アッセイでは、蛇 AAV キャプシド アセンブリ蛇 AAP を必要とし、AAV5 と AAV9 から薬学会合同によって昇格できませんを明らかにしました。試金はまた、一般的な血清型異種キャプシド アセンブリを促進する相互補完によって薬学会合同の多くとは異なり蛇 AAP を促進しない AAV9 カプシドのアセンブリを示した。ヌクレアーゼの選択に大きく影響するドット プロット法の読み出し、したがって、最適な酵素を選択することは、AAV 価の成功評価のため重要です。 さらに、示します。
Introduction
アデノ随伴ウイルス (AAV) は、約 4.7 kilobases (kb) のゲノムと小さく、非エンベロープ、一本鎖 DNA ウイルスです。AAV のゲノムには、担当者とキャップの遺伝子のオープンリーディング フレーム (Orf) が含まれています。2010 年、AAV2キャップ遺伝子内の +1 フレーム シフト ORF がエンコードされた未知の非構造蛋白だったゾンタークらによって発見され、ウイルス AAV2 VP 単量体蛋白質のアセンブリで重要な役割を果たすことが判明カプシド1。この蛋白質はキャプシド アセンブリ1の推進における役割後アセンブリ活性化タンパク質 (AAP) を選ばれました。
AAP の ORFs 属Dependoparvovirus、内がパルボ ウイルス家族1,2の別属のウイルスのゲノム内にないすべてのパルボ ウイルスのゲノムの特定の bioinformatically をされています。この蛋白質の機能調査された最初 AAP AAV2 のプロトタイプから (AAP2)、集積の形成に核小体に組み立ての VP 蛋白質を完全にターゲットに AAP2 の重要な役割を確立しているに焦点を当ててください。カプシド1,3、4を組み立てください。AAV2 カプシドの AAP 式の不在でアセンブルすることができないが個別にされている我々 を含む複数のグループによる1,2,3,4,5 を確認.AAV 血清型 1、8、および 9 の後の研究に裏付け薬学会合同の AAV1、8 の VP3 単量体蛋白質とキャプシド アセンブリ内の重要な役割と 9 は AAP2の共発現の不在で完全に組み立てられた構造を形成することができませんでした。
最近では、定量的なドットの使用を含むアプローチを試金のしみ、AAP の発現の有無と AAP1 の能力で縁どら VP3 モノマーからのアセンブリを促進するために 12 をアセンブルする 12 VP3 モノマーに AAV1 の機能を調べた異種血清型。本研究は明らかにその AAV4、5 と 11 の VP3 モノマーが AAP なく組み立てることができます。さらに、調べた 12 の AAP の血清型のうち 8 つがわかっただった (すなわち、すべてが AAP4、5、11、および 12) AAP4、5、11、12 を表示中、異種の AAV 血清型カプシドのキャプシド アセンブリをサポートする広範な権限を表示、大幅にこの点6の限られた能力。これらの 4 つの血清型が系統他 AAP 血清型2,の3から遠いです。また、研究では異なる薬学会合同6の細胞レベル下のローカリゼーションの重要な不均一性が明らかになった。さらに、研究は、組み立てられたカプシドと核小体、AAV2 キャプシド アセンブリの特徴 AAP の緊密な関連を AAV5 を含む他の血清型に拡張して必ずしもできないことを示唆している 8、および 9 は、核小体の排除を表示組み立てカプシド6。したがって、任意の特定の血清型 AAP の研究から得られる情報はすべて AAP 生物に広く適用できません。AAP の生物学のような不可解な性質は、正規と非正規の AAV 血清型から各 AAP の機能と役割を調査する必要性を強調します。
人間の萌芽期の腎臓 (HEK) で AAV のウイルスの粒子の完全パッケージ化抗体生産 293 細胞 AAV のベクトル生産、AAP の蛋白質の有無の最も一般的に使用されるセル行の決定によって評価されるキャプシド アセンブリの AAP の生物学的役割式です。AAV を定量化するための標準的な方法は量的な PCR (qPCR)-基づいた試金7,8としみに基づく定量的ドット9を試金します。酵素免疫アッセイ10,11など光学密度計測12 AAV ウイルス粒子の定量のための他の方法は、多くの異なる AAV の血清型に由来サンプルまたはサンプル不純物 (粗野な lysates または文化メディア)、AAV の研究に使用されるサンプルが多いと汚染されます。現在、qPCR 最も広く AAV 定量; の使用します。ただし、システム エラーや大きな価変動13,14qPCR ベース試金の試金としての潜在的な注意事項が発生を確認する必要があります。PCR に基づく試金は潜在的交絡増幅13を阻害する PCR テンプレートで共有閉じたターミナル ヘアピンの存在などの要因の数の影響を受けます。経験豊富な人であっても潜在的な紹介 qPCR ベースに交絡要因を無意識のうちに13試金。対照的に、定量的なドットのしみアッセイ、ゲノム増幅を必要としない、qPCR に基づく試金と比較してエラーの最小限のリスクで多くの単純な原理を使用して古典的な分子生物学手法です。このメソッドは技術的に困難な; 以下したがって、アッセイ結果が合理的に経験の浅い個人によっても再現可能です。
本報告では、AAV ベクターを定量化するために使用、(AAV5 と AAV9) の血清型共通の薬学会合同のアセンブリ促進の役割を勉強するアッセイを適用する方法と例を提供しています定期的に定量的なドットのしみの試金の方法論の詳細について述べる以前メタボライト AAP 蛇 AAV14から。自然の中で AAV VP 蛋白質および AAP 蛋白質は単一の遺伝子 (すなわち、VP AAP cis 補完) 中でここで説明アッセイから cis で表されます、VP、AAP の蛋白質は 2 つの独立したプラスミド (すなわち、VP AAP からトランスで指定されました。トランス-補完)。それぞれ異なる血清型から各 VP または AAP 蛋白質は、それぞれ独立したプラスミドから表現できる、キャプシド アセンブリ (つまり、VP AAP クロス補完) の異種の VP AAP の組み合わせをテストすることが可能になります。簡単に言えば、様々 な血清型から AAV VP3 は同種の血清型 AAP、または異種血清型 AAP の存在の有無で、AAV ベクター ゲノムをパッケージ化するプラスミド DNA トランスフェクションによって HEK 293 細胞で表されます。次の生産、文化メディアとセル lysates はキャプシド シェル内でウイルスのゲノムを定量化するドット プロット法にさらされます。点のしみの分析の最初の手順は、サンプルの汚染のプラスミド Dna とアンパックの AAV のゲノムを削除するヌクレアーゼとサンプルを扱うことです。そう失敗は unpurified サンプル試金されるとき、背景信号を特に増加させます。ウイルスのカプシドを破るし、サンプル ソリューションにヌクレアーゼ耐性ウイルスのゲノムを解放するプロテアーゼ処理によるこれは後します。次に、ウイルスのゲノムは、変性、膜の quantitation のためウイルス ゲノム特定 DNA プローブとハイブリダイズします。蛇 AAV VP3 がキャプシド アセンブリの蛇 AAP を必要とし、ヘビ AAP が薬学会合同総会を促進することも AAP 依存型の血清型に由来の多くとは異なり AAV9 カプシドのアセンブリを促進しないことを示すここで報告例の分析で異種血清型カプシド。最後に、我々 は qPCR に重要な注意点を報告またはドットのしみベース AAV 定量アッセイ ヌクレアーゼの選択は、分析結果に対して大きな影響を及ぼすこと。
Protocol
Representative Results
Discussion
本報告では、AAV 薬学会合同とキャプシド アセンブリでの役割を研究する定量的ドットしみアッセイの有用性を説明します。これらの研究から得られた知識は、AAV キャプシド アセンブリの過程で生得的な違いとそれぞれ異なる血清型間薬学会合同の機能的役割に関する詳細情報を提供できます。この点で、AAV VP3 AAP クロス補完ドットしみアッセイ蛇 AAV VP3 はキャプシド アセンブリの同種の A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シャオシャオ ノースカロライナ大学チャペルヒル校でにありがとう pEMBL CMV GFP プラスミドを提供してくれる。原稿の批判的な読み、クリストファー ・ チェンとサミュエル ・ j ・黄に感謝します。この作業によって支えられた公衆衛生サービスを付与 (NIH R01 NS088399 ・ T32 EY232113)。
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
References
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
- Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
- Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
- Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
- Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
- Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
- Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
- Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
- NEB, . 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , 302-368 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- . Bacterial Transformation Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017)
- . Sequence Analysis of your Addgene Plasmid Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017)
- Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
- Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
- Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
- Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
- Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
- Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).
