AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

Summary

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

Abstract

Adeno 관련 바이러스 (AAV)은 유전자 치료를 위한 매력적인 벡터로 널리 허용 된다, 그러나 그것은 또한 바이러스 생물학을 이해 하기 위한 모델 바이러스 역할. 후자의 점에서 어셈블리 활성화 단백질 (AAP), 불리는 비 구조 AAV 단백질의 최근 발견은 capsid에 바이러스 성 capsid 부사장 단백질의 조립에 관련 된 프로세스에 새로운 빛을 발산 하 고. 많은 AAV serotypes 어셈블리에 대 한 AAP를 필요, 우리는 최근 보고는 AAV4, 5, 11는이 규칙에 예외. 또한, 우리는 AAPs 및 다른 serotypes의 조립된 capsids 다른 subcellular 구획을 지역화 설명 했다. 생물 학적 속성 및 다른 AAV 중 AAPs의 기능적인 역할에이 예기치 않은 serotypes 밑줄 다양 한 serotypes에서 파생 된 AAPs에 대 한 연구의 중요성 이 원고는 AAV 정량 및 capsid 어셈블리에서 AAP 종속성 및 serotype 특이성을 평가 하는 응용 프로그램에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 자세히 설명 합니다. 이 점 오 점 분석 결과의 유틸리티를 보여, 우리가 밖으로 설정 capsid 어셈블리 및 AAP 종속성 뱀 AAV 이전 새롭거나 파충류 AAV로 AAV5, AAV9, AAP 독립 및 AAP 종속 이전에 표시의 특성 serotypes, 각각. 분석 결과 뱀 AAV capsid 어셈블리 뱀 AAP를 요구 한다 AAV5와 AAV9에서 AAPs에 의해 승진 될 수 없습니다 밝혔다. 분석 결과 또한, 많은 일반적인 serotype AAPs 상호 보완성으로 분리 capsid 어셈블리를 홍보 하는, 달리 뱀 AAP 홍보 하지 않습니다 AAV9 capsids의 다는 것을 보여주었다. 또한, 우리 nuclease의 선택은 크게 점 오 점 분석 결과의 판독에 영향을 하 고 따라서, 최적의 효소를 선택 하는 것은 AAV titers의 성공적인 평가 위해 매우 중요 표시.

Introduction

Adeno 관련 바이러스 (AAV) 작은, 비 싸여, 단일 가닥 DNA 바이러스 게놈의 약 4.7 kilobases (kb)입니다. AAV 게놈 오픈-독서 프레임 (ORFs) 담당자 와 모자 유전자에 대 한 포함 되어 있습니다. 2010 년 이전 미확인된 nonstructural 단백질 AAV2 모자 유전자 내에서 + 1 프레임 이동 ORF 의해 월요일 외 에 의해 발견 되었고 발견 바이러스에 AAV2 capsid 부사장 단위체 단백질의 조립에 중요 한 역할을 capsid¹. 이 비 발한 단백질은 capsid 어셈블리¹을 추진에서 역할 그것 후 어셈블리 활성화 단백질 (AAP) 선정 되었습니다.

ORFs AAP에 대 한 모든 parvoviruses 속 Dependoparvovirus, 내만 내 parvovirus 가족^1,2의 다른 속의 바이러스의 게놈의 유전자 확인 된 bioinformatically 되었습니다. 이 비 발한 단백질의 기능 연구는 AAP AAV2 프로토 타입에서 (AAP2), AAP2의 필수적인 역할에 완전히 그들의 축적과 형성에 대 한 핵소체 unassembled 부사장 단백질을 대상으로 설립에 초점을 처음 했다 조립 capsids^1,,34. 압 식의 부재에 조립 하는 AAV2 capsids의 무 능력은 독립적으로 되어^{1,2,,34,5 우리를 포함 한 여러 그룹에 의해 확인} . AAV serotypes 1, 8, 및 9에 대 한 후속 연구 capsid 어셈블리, AAV1, 8의 VP3 단위체 단백질에에서 AAPs의 중요 한 역할을 뒷받침 9 AAP²의 공동 식의 부재에서 완벽 하 게 조립된 capsid를 형성 하지 못했습니다.

최근, 양적 점의 사용을 포함 하는 접근 방법을 통해 분석 실험을 오 점, 우리 조사 수 AAV1의 12 VP3 단위체에서 VP3 단위체의 홍보 12 capsids 압 식의 부재와 AAP1의 능력으로 조립 분리 serotypes입니다. 이 연구는 밝혔다 그 AAV4, 5, 및 11 VP3 단위체 AAP 없이 어셈블할 수 있습니다. 또한, 그것은 8 12 AAP serotypes 우리가 검사에서 발견 되었다 (즉, 모든 AAP4, 하지만 5, 11 및 12) AAP4, 5, 11 및 12에 표시 하는 동안 분리 AAV serotype capsids capsid 집합을 지원 하기 위해 광범위 한 능력을 표시는 실질적으로 이 관계⁶제한 된 능력입니다. 이 4 개의 serotypes phylogenetically 먼 다른 AAP serotypes^2,3에서 있습니다. 또한, 연구는 다른 AAPs⁶의 subcellular 지 방화에서 중요 한이 발견 했다. 또한, 연구는 조립된 capsids과 핵소체, AAV2 capsid 어셈블리의 특징 AAP의 단단한 협회 AAV5를 포함 하 여 다른 serotypes에 반드시 확장할 수 없습니다 제안 했다 8, 및 9의 nucleolar 제외 표시 조립된 capsids⁶. 따라서, 어떤 특정 serotype AAP의 연구 로부터 얻은 정보는 모든 AAP 생물학에 광범위 하 게 적용 되지 않습니다. 압 하 고 생물학의 수수께끼 같은 자연 밑줄 정규 및 비정규 AAV serotypes에서 각 AAP의 기능과 역할을 조사 하는 필요.

Capsid 어셈블리에서 AAP의 생물학 역할 완전 포장 AAV 바이러스 성 입자 titers에서에서 생산 인간 미 발달 신장 (HEK) 293 세포, AAV 벡터 생산, 또는 AAP 단백질 없이 가장 일반적으로 사용 되 셀 라인을 확인 하 여 평가 될 수 있다 식입니다. AAV 정량의 표준 방법으로는 정량적 PCR (정량)-근거한 분석 실험^7,8 및 양적 점 오 점 기반 분석 실험⁹. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과^10,11 등 광학 밀도 측정¹² AAV 바이러스 성 입자 정량에 대 한 다른 방법 많은 다른 AAV serotypes에서 파생 된 시료에 적합 하지 않습니다. 불순물 (원유 lysates 또는 문화 미디어), AAV 연구에 사용 되는 예제는으로 오염. 현재, 정량은 가장 널리 사용 되 AAV 정량; 그러나, 그것은 잠재적인 주의 정량 기반 분석 결과, 분석 결과로 체계적 오류 및 중요 한 titer 유사^13,14귀 착될 수 있다 인정 하는 데 필요한. PCR 기반 분석 실험은 잠재적으로 혼동 요인, 증폭¹³을 억제 하는 PCR 서식 파일에서 covalently 닫힌된 터미널 헤어핀의 존재 등의 숫자에 의해 영향을 받습니다. 심지어 경험이 개인 잠재력을 소개 수 정량 기반으로 혼동 요인 시험¹³의 무의식적으로. 반면, 양적 점 오 점 분석은 게놈 증폭을 포함 하지 않는 매우 간단한 원리를 사용 하 여 정량 기반 분석 실험에 비해 오류의 위험을 최소화 하는 고전 분자 생물학 기술. 방법은 덜 기술적으로 도전; 따라서, 시험 결과 미숙한 개인에 의해 합리적으로 재현.

이 보고서에서 우리는 양적 점 오 점 분석 결과 우리가 일상적으로 AAV 벡터 정량에 대 한 사용 하 고 어떻게 공통 AAPs의 어셈블리 홍보 역할 연구 분석 결과 적용 하려면 serotypes (AAV5 및 AAV9) 및의 예를 제공의 방법론 세부 설명 뱀 AAV¹⁴에서 이전 새롭거나 AAP 자연, AAV 부사장 단백질 및 AAP 단백질 단일 유전자 (즉, 부사장-AAP cis-보완성), 동안 여기서 설명 하는 분석 결과에서에서 cis에서 표현 됩니다, 그리고 부사장 및 AAP 단백질 (즉, 부사장-압 하 고 두 개의 별도 플라스 미드에서 트랜스에서 공급 된다 트랜스-보완성)입니다. 이후 다른 serotypes에서 각 부사장 또는 AAP 단백질 각 독립적인 플라스 미드에서 표현 될 수 있다, 그것은 capsid 어셈블리 (즉, 부사장-AAP 크로스-보완성) 분리 부사장 AAP 조합을 테스트할 수 된다. 간단히, 다양 한 serotypes에서 AAV VP3 HEK 293 세포 존재 또는 부재의 동족 serotype AAP, 또는 분리 serotype AAP의 존재는 AAV 벡터 게놈을 포장 하는 플라스 미드 DNA transfection에 의해 표현 된다. 생산, 다음 문화 미디어와 세포 lysates capsid 셸 내 바이러스 성 게놈을 계량 점 오 점 분석 결과를 받게 됩니다. 점 오 점 분석 결과의 첫 번째 단계 샘플 샘플에 오염 플라스 미드 DNAs 및 비포장된 AAV 게놈을 제거 하는 nuclease 치료 하는 것입니다. 이렇게 하지 않으면 것 증가 배경 신호 특히 unpurified 샘플 분석. 이것 다음 바이러스 성 capsids 휴식과 샘플 솔루션으로 nuclease 내성 바이러스 성 게놈을 풀어 효소 처리에 의해 선행 된다. 다음, 바이러스 성 게놈 변성, 막에 얼룩이 고 정량에 대 한 바이러스 성 게놈 관련 DNA 프로브 때 교배. 여기 보고 예제 분석 결과 보여 줍니다 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 뱀 AAP를 요구 하 고 뱀 압 달리의 홍보 또한 수 AAP 종속 serotypes에서 파생 된 AAPs의 많은 AAV9 capsids 어셈블리를 홍보 하지 않습니다. 분리 serotype capsids입니다. 마지막으로, 우리 정량 하는 중요 한 경고를 보고 또는 점 오 점 기반 AAV 정량 분석 실험 nuclease의 크게 시험 결과 영향을.

Protocol

참고: 솔루션 및이 프로토콜에 대 한 필요한 버퍼 조리법은 표 1에 제공 됩니다. 아래에 설명 된 프로토콜 capsid 어셈블리에서 AAP 단백질의 역할을 연구 부사장 AAP 상호 보완성 점 오 점 분석 결과입니다. 순화 AAV 벡터 적정에 대 한 보다 일반적인 양적 점 오 점 분석 결과 대 한 방법은 대표 결과 섹션에서 설명 합니다. 1. 건설 VP3, AAP, 플라스 미드를 표현 …

Representative Results

순화 AAV 벡터 주식 대규모 생산의 정량에 대 한 양적 도트도 말의 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 이 점 오 점 분석 결과 함께 더블-좌초 AAV2G9-CMV-GFP 벡터 재고 titer 결정 했다. 벡터는 세 슘 염화 물 (CsCl) 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 다음 앞에서 설명한20으로 투 석의 두 라운드 순화 되었다. 일반적으로, 순화 AAV 벡터 주식에…

Discussion

이 보고서에서 AAPs AAV capsid 어셈블리에서 그들의 역할을 공부 하 고 양적 점 오 점 분석 실험의 유틸리티를 설명 합니다. 이러한 연구에서 얻은 지식을 AAV capsid 어셈블리 과정에서 타고 난 차이 다른 serotypes 사이 AAPs의 기능적인 역할에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 점에서 AAV VP3 AAP 상호 보완성 점 얼룩 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 그것의 동족 AAP의 공동 식에 엄격한 종속성 ?…

Materials

Benzonase	MilliporeSigma	1016970001	Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I	Roche	4716728001	Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I	Invitrogen	18047019	Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I	New England Biolabs	M0303L	Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes	Corning	430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352097
3 M Sodium Acetate	Teknova	S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	430291
AAV-293 Cells	Agilent	240073	HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution	Lonza	51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0	Lonza	51238
AccuGENE 10% SDS	Lonza	51213
AccuGENE 1X TE Buffer	Lonza	51235
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Bovine Serum Albumin	MilliporeSigma	A3294
Cell Lifter	Corning	3008
Chloroform	MilliporeSigma	372978
DNA Extractor Kit	Wako Pure Chemical Industries	295-50201	This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L)	Lonza	12-614F
ElectroMAX DH10B Cells	Thermo Fisher Scientific	18290015
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2716
Fetal Bovine Serum	VWR	1500-500
Ficoll 400	Alfa Aesar	B22095	Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axiovert 40 CFL
Glycogen	Roche	10901393001
Herring Sperm DNA	Invitrogen	15634-017
Hybridization Tubes	Thermo Fisher Scientific	13-247-150
ImageQuant TL	GE Healthcare Life Sciences	ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM	Lonza	17-605E
Magnesium Choloride Hexahydrate	MilliporeSigma	M0250
MicroPulser Electroporator	Bio-Rad	1652100
Mini Quick Spin DNA Columns	MilliporeSigma	11814419001
pAAV-RC2 Vector	Cell Biolabs Inc	VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	17-602E
Phosphate Buffered Saline	Lonza	17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette	GE Healthcare Life Sciences	Various
Phosphorimaging Screen	GE Healthcare Life Sciences	Various
Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Polyethylenimine	Polysciences Inc	23966-2
Polyvinylpyrrolidone	MilliporeSigma	P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit	Agilent Technologies	300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Proteinase K Solution	Invitrogen	25530-049
Restriction Enzymes	New England Biolabs	Various
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15632011
Serological Pipettes	Thermo Fisher Scientific	13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate	MilliporeSigma	C8532
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203L
Thermal Cycler	Eppendorf	6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate	Corning	353046
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	BP152-5
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol	Invitrogen	15513-047
UV Crosslinker	Spectroline	XLE-1000	Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane	Bio-Rad	162-0165