Infecção por vírus Zika do cérebro Fetal humano culta células-tronco neurais para análise de Immunocytochemical
Summary
Este artigo detalha os métodos que são usados para expandir as células-tronco neurais cérebro fetal humano na cultura, bem como diferenciá-los em vários subtipos neuronais e astrócitos, com ênfase na utilização de células-tronco neurais para estudar a infecção pelo vírus Zika.
Abstract
Células-tronco neurais cérebro fetal humano são um sistema único modelo não-geneticamente modificados para estudar o impacto de vários estímulos na neurobiologia do desenvolvimento humano. Prefiro a usar um modelo animal ou células pluripotentes induzidas geneticamente modificados, células-tronco neurais humanas fornecer um sistema eficaz em vitro para examinar os efeitos dos tratamentos, drogas de tela, ou examinar as diferenças individuais. Aqui, nós fornecemos os protocolos detalhados para os métodos utilizados para expandir as células-tronco neurais cérebro fetal humano na cultura com media serum-free, para diferenciá-los em vários subtipos neuronais e astrócitos através de procedimentos diferentes de escorva, para congelar e recuperar Estas células. Além disso, descrevemos um procedimento de usando células-tronco neurais cérebro fetal humano para estudar a infecção pelo vírus Zika.
Introduction
Vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus transmitido sexualmente ou por mosquitos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus mosquitos. ZIKV foi recentemente identificada como uma ameaça grave de saúde pública devido à sua facilidade de transmissão e sintomas neurológicos1de afiliados. Um dos mais relativas aos efeitos neurológicos é o desenvolvimento de microcefalia em fetos nascidos de mães grávidas infectadas2,3. A microcefalia é um distúrbio neurológico, onde a cabeça é menor do que o tamanho típico durante o desenvolvimento fetal e ao nascimento, com a circunferência menor que 2 desvios-padrão abaixo da média4. A menor circunferência da cabeça é geralmente acompanhada por uma variedade de comorbidades tais como atrasos no desenvolvimento, convulsões, visão e perda de audição e dificuldade de alimentação.
Estudos recentes têm utilizado modelos animais ou induzida por células-tronco pluripotentes para estudar o efeito da infecção ZIKV em neurodesenvolvimento5,6,7,8. Enquanto estes estudos têm contribuído para o nosso conhecimento de ZIKV, o uso de diferentes espécies ou células geneticamente modificadas podem ser demorado e/ou adicionar variáveis adicionais que podem confundir o efeito da ZIKV no desenvolvimento neural células5, 6 , 7 , 8. no entanto, a dificuldade com a cultura do hNSC, particularmente a cultura de não-aderente neurosphere descrita neste protocolo, é que a cultura é muito sensível aos métodos utilizados para realizar a cultura9. Qualquer alteração em componentes médios, ou mesmo a manipulação física do navio cultura, é suficiente para provocar uma reação de9células. Para solucionar esses problemas, nós desenvolvemos uma cultura humana fetal derivado do cérebro neural células-tronco (hNSCs) em vitro para interrogar mecanicamente o efeito da ZIKV em células-tronco neurais fetais. Usando nosso método, hNSCs foram mantidos por mais de 80 passagens sem alterações fenotípicas aparente10. Além disso, alterações cromossômicas, como trissomia eram um none ou mínimo11. Esta cultura hNSC cresce como uma cultura de não-aderente neurosphere. Uma vantagem do neurospheres é que as esferas criam um nicho ambiental na cultura que é mais reflexiva de nichos na vivo em comparação com as culturas bidimensional9. Outra vantagem deste protocolo é que vários tipos de células podem ser derivados da cultura hNSC, permitindo que um investigador observar o impacto de uma determinada variável na sobrevivência do hNSC e diferenciação. Este protocolo é aplicável a indivíduos que olham para responder perguntas mecanicistas sobre o desenvolvimento do sistema nervoso central ou disfunção. O protocolo seguinte descreve como expandir uma cultura hNSC para infectar com ZIKV e posteriormente, diferenciar o hNSCs para observar o impacto da infecção sobre o processo de diferenciação. Ele também inclui métodos para armazenar hNSCs para o uso a longo prazo e hNSCs se diferenciar em vários tipos de neurônios que permitam a investigação dos défices induzida por ZIKV contribuindo para de malformação do cérebro11. Acreditamos que este protocolo também é de interesse para os investigadores procuram entender o impacto de qualquer estímulo ambiental, tais como infecção ou toxinas na sobrevivência de células-tronco neurais e diferenciação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de cultura e manipular hNSCs fornece uma ferramenta crítica que pode ser usada para uma variedade de finalidades da modelagem de doenças humanas para10,11,12,14, de despistagem de drogas de alto rendimento 15,16,17. Muitas perguntas continuaram a ser abordadas como cérebro f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por fundos do S. John Dunn Foundation e do Instituto para infecções humanas e imunidade da University of Texas Medical Branch (PW).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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