Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical
Summary
Este artículo detalla los métodos que se utilizan para expandir células madre neurales de cerebro fetal humano en la cultura, así como distinguir diferentes subtipos neuronales y astrocitos, con énfasis en el uso de células madre neurales para el estudio de la infección del virus Zika.
Abstract
Células madre neurales de cerebro fetal humano son un sistema modelo único non-genetically modificada para estudiar el impacto de varios estímulos en Neurobiología del desarrollo humano. Más bien que utilice un modelo animal o células pluripotentes inducidas genéticamente, células madre neurales humanas proporcionan un sistema efectivo en vitro para examinar los efectos de los tratamientos, medicamentos de la pantalla, o estudiar las diferencias individuales. Aquí, le ofrecemos protocolos detallados para los métodos utilizados para expandir células madre neurales de cerebro fetal humano en cultura con medios libres de suero, para diferenciarlas en varios subtipos neuronales y los astrocitos mediante procedimientos diferentes de cebado y para congelar y recuperar Estas células. Además, describimos un procedimiento del uso de células madre neurales de cerebro fetal humano para estudiar la infección del virus Zika.
Introduction
Zika virus (ZIKV) es un flavivirus transmitido sexualmente o por los mosquitos mosquitos vectores Aedes aegypti y Aedes albopictus . ZIKV fue identificado recientemente como una amenaza grave de salud pública debido a su facilidad de transmisión y afiliado síntomas neurológicos1. Uno de los más relativos a efectos neurológicos es el desarrollo de microcefalia en los fetos nacidos de madres infectadas embarazadas2,3. Microcefalia es un trastorno del neurodesarrollo, donde la cabeza es más pequeña que el tamaño típico durante el desarrollo fetal y en el nacimiento, con la circunferencia menor de 2 desviaciones estándar por debajo de la media4. La circunferencia principal más pequeño comúnmente se acompaña de una variedad de comorbilidades tales como retrasos en el desarrollo, convulsiones, visión y pérdida de la audición y dificultad para la alimentación.
Estudios recientes han utilizado modelos animales o inducida de pluripotent células para estudiar el efecto de la infección por ZIKV en neurodesarrollo5,6,7,8. Mientras que estos estudios han contribuido a nuestro conocimiento de ZIKV, el uso de diferentes especies o células genéticamente modificadas pueden ser lentos o agregar variables adicionales que pueden confundir el efecto de ZIKV en desarrollo neural células de5, 6 , 7 , 8. sin embargo, la dificultad con hNSC cultura, particularmente la desarrolló no adherente se describe en este protocolo, es que la cultura es muy sensible a los métodos utilizados para llevar a cabo la cultura9. Cualquier cambio en los componentes medianos, o incluso la manipulación física de la vasija de la cultura, es suficiente para provocar una reacción de las células9. Para abordar estas cuestiones, desarrollaron una cultura de fetal derivado neural células madre humanas (hNSCs) en vitro para mecánico interrogar el efecto de ZIKV sobre las células madre neurales fetales. Con nuestro método, hNSCs se mantuvieron por más de 80 pasajes sin aparentes cambios fenotípicos10. Además, alteraciones cromosómicas como la trisomía del par fueron ya sea ninguno o mínimo11. Esta cultura hNSC crece como una cultura desarrolló no adherente. Una ventaja de neuroesferas es que las esferas crean un nicho ambiental único en la cultura que se refleja más en vivo lugares en comparación con las culturas dos dimensiones9. Otra ventaja de este protocolo es que múltiples tipos de células se pueden derivar de la cultura hNSC, permitiendo a un investigador observar el impacto de una variable dada en hNSC supervivencia y diferenciación. Este protocolo es aplicable a las personas para responder a preguntas mecanicistas sobre el desarrollo del sistema nervioso central o disfunción. El siguiente protocolo describe cómo expandir una cultura hNSC para infectar con ZIKV y posteriormente diferenciar la hNSCs para observar el impacto de la infección en el proceso de diferenciación. También incluye métodos para almacenar hNSCs para el uso a largo plazo y hNSCs se diferencian en varios tipos de neuronas que permiten más investigación de déficits inducidos por ZIKV contribuyendo al cerebro malformación11. Creemos que este protocolo también es de interés para los investigadores que buscan entender el efecto de cualquier estímulo ambiental como infección o toxinas en la supervivencia de células madre neurales y diferenciación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de la cultura y manipular hNSCs proporciona una herramienta fundamental que puede ser utilizada para una variedad de propósitos de modelar enfermedades humanas a10,11,12,14, de detección de drogas de alto rendimiento 15,16,17. Muchas preguntas seguían siendo para abordarse c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los fondos de la John S. Dunn Foundation y el Instituto de infecciones humanas y de la inmunidad de la rama médica de la Universidad de Texas (P.W.).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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