Kültürlü insan Fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu Immunocytochemical analiz için
Summary
Bu makalede insan fetal beyin sinir kök hücreleri kültür, hem de onları içine çeşitli nöronal alt türlerini ve astrocytes sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu çalışmaya kullanımı üzerine vurgu ile ayırt etmek nasıl genişletmek için kullanılan yöntemleri ayrıntıları.
Abstract
İnsan fetal beyin sinir kök hücreleri insan gelişimsel Nörobiyoloji üzerinde çeşitli uyaranların etkisini incelemek için benzersiz olmayan genetiği değiştirilmiş modeli sistemi vardır. Daha doğrusu bir hayvan modeli ya da genetik olarak değiştirilmiş İndüklenmiş pluripotent hücreler kullanımına oranla, insan sinir kök hücreleri tedaviler, ekran uyuşturucu, etkilerini incelemek veya bireysel farklılıklar incelemek için bir etkili vitro sistemi sağlama. Burada, insan fetal beyin sinir kök hücreleri kültür onları içine çeşitli nöronal alt türlerini ve astrocytes yolu ile farklı astar yordamlar, ayırt etmek ve donma ve kurtarmak için serum-Ücretsiz medya ile genişletmek için kullanılan bir yöntem için detaylı protokolleri sağlamak Bu hücreler. Ayrıca, biz insan fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu çalışmaya kullanmanın bir açıklayınız.
Introduction
Zika virüstür (ZIKV) cinsel ya da sivrisinek vektörel çizimler Aedes aegypti ve Aedes albopictus sivrisinekler tarafından iletilen bir flavivirus. ZIKV son zamanlarda iletim kolaylığı nedeniyle şiddetli halk sağlığı tehdit olarak tespit edildi ve nörolojik belirtiler1bağlı. En nörolojik etkileri ile ilgili olduğunu microcephaly fetus enfekte hamile anneler2,3‘ e tarihi gelişimi. Microcephaly baş fetal gelişim sırasında ve çevresi daha az 2 standart sapma ortalama4aşağıda ile doğumda normal boyutundan daha küçük nerede bir nörogelişimsel bozukluktur. Küçük baş çevresi yaygın gelişimsel gecikmeler, nöbetler, görme ve işitme kaybı ve zorluk besleme gibi comorbidities çeşitli eşlik ediyor.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda hayvan modellerinde kullanılan veya pluripotent kök hücreler açıkların5,6,7,8ZIKV enfeksiyon etkisini incelemek için indüklenen. Bu çalışmalar için ZIKV, farklı tür kullanımı ile ilgili bilgilerimizi bulunmuştur ya da genetik olarak değiştirilmiş hücreler ve/veya zaman alıcı ZIKV etkisi üzerinde yıkmak başka değişkenler eklemek iken sinirsel geliştirme5, hücreleri 6 , 7 , 8. ancak, zorluk ile hNSC kültür, özellikle bu protokol için açıklanan yapışık olmayan neurosphere Kültür Kültür Kültür9yapmak için kullanılan yöntemleri çok hassas olmasıdır. Herhangi bir değişiklikten orta bileşenleri veya kültür gemi bile fiziksel işlenmesi bir tepki hücreleri9temin için yeter. Bu sorunlara yönelik olarak geliştirdiğimiz bir vitro insan fetal beyin kaynaklı nöral kök hücre (hNSCs) kültür mechanistically ZIKV etkisi fetal sinir kök hücreleri sorgulamaya. Bizim yöntemini kullanarak, hNSCs olmadan belirgin fenotipik değişiklikler1080’den fazla pasajlar için muhafaza. Ayrıca, Trizomi gibi kromozomal değişiklikler ya yok edildi ya da en az11. Bu hNSC kültür bir yapışık olmayan neurosphere kültür olarak büyür. Bir neurospheres küreler içinde vivo niş iki boyutlu kültürler9‘ a göre daha yansıtıcı kültür benzersiz bir çevre niş oluşturun avantajdır. Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı hNSC hayatta kalma ve farklılaşma belirtilen değişkeni etkisini gözlemlemek için bir dedektif etkinleştirme birden çok hücre tipleri hNSC kültüründen türetilebilir var. Bu iletişim kuralı, merkezi sinir sistemi geliştirme veya fonksiyon bozukluğu ile ilgili mekanik sorulara cevap arayan kullanıcılar için geçerlidir. Aşağıdaki iletişim kuralı ile ZIKV bulaştırmak ve sonradan ortaya çıkan enfeksiyon farklılaşma süreci etkisini gözlemlemek için hNSCs ayırt etmek için bir hNSC kültür genişletmek nasıl açıklar. Ayrıca hNSCs uzun vadeli kullanım için depolamak ve daha fazla beyin malformasyonu11‘ e katkıda ZIKV kaynaklı açıkları incelenmesi izin nöronların çeşitli türleri içine hNSCs ayırt etmek için yöntemler içerir. Bu iletişim kuralı da enfeksiyon veya toksinler nöral kök hücre hayatta kalma ve farklılaşma gibi çevre herhangi bir uyarıcı etkisini anlamak isteyen araştırmacılar için ilgi olduğunu düşünüyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kültür ve hNSCs çeşitli insan hastalık10,11,12,14eleme yüksek işlem hacmi uyuşturucu için modelleme gelen amaçlar için kullanılan kritik bir araç sağlar, 15,16,17. Nasıl insan fetal beyin NSCs gibi ele alınması gereken birçok soru kaldı ya da onların döl ZIKV enfeksiyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser fonlarından John S. Dunn Vakfı ve insan enfeksiyonları ve Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi (PW) dokunulmazlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
