Summary
Dieser Artikel beschreibt die Methoden, die verwendet werden, um die menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen in Kultur, sowie zur Unterscheidung in verschiedenen neuronalen Subtypen und Astrozyten, mit einem Schwerpunkt auf den Einsatz von neuronalen Stammzellen Zika-Virus-Infektion zu studieren zu erweitern.
Abstract
Menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen sind eine einzigartige gentechnisch nicht veränderten Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Reize auf menschliche Entwicklungsneurobiologie. Eher als Tiermodell oder gentechnisch veränderten induzierten pluripotenten Zellen verwenden, bieten menschlichen neuronalen Stammzellen ein wirksam in-Vitro -System zu untersuchen die Auswirkungen der Behandlungen, Bildschirm Drogen oder individuelle Unterschiede zu untersuchen. Hier bieten wir ausführliche Protokolle für Methoden zur menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen in Kultur mit serumfreien Medien, um sie in verschiedenen neuronalen Subtypen und Astrozyten über verschiedene Priming Verfahren unterscheiden und Einfrieren und wieder erweitern Diese Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen Zika-Virus-Infektion zu studieren.
Introduction
Zika-Virus (ZIKV) ist ein Flavivirus, sexuell oder durch die Vektoren Mücke Aedes Aegypti und Aedes Albopictus Mücken übertragen. ZIKV wurde vor kurzem als schwere öffentliche Gesundheitsbedrohung wegen seiner Mühelosigkeit der Übertragung identifiziert und neurologische Symptome1angeschlossen. Eines der wichtigsten über neurologische Wirkungen ist die Entwicklung einer Mikrozephalie bei Feten zu infizierten schwangeren2,3geboren. Mikrozephalie ist eine Neurodevelopmental Störung, wo ist der Kopf kleiner als die typische Größe während der fetalen Entwicklung und bei der Geburt, mit dem Umfang von weniger als 2 Standardabweichungen unter dem Mittelwert4. Die kleineren Kopfumfang wird häufig durch eine Vielzahl von Begleiterkrankungen wie Entwicklungsverzögerungen, Ergreifungen, Vision und Hörverlust und Fütterung Schwierigkeiten begleitet.
Jüngste Studien haben Tiermodelle verwendet oder induzierte pluripotente Stammzellen, die Wirkung der ZIKV Infektion auf Neurodevelopment5,6,7,8zu studieren. Während dieser Studien dazu, unser Wissen über ZIKV, die Verwendung von verschiedenen Arten beigetragen haben oder genetisch veränderte Zellen können sehr zeitaufwändig sein und/oder fügen Sie weitere Variablen, die die Wirkung von ZIKV auf verwirren können Zellen Entwicklung von neuronalen5, 6 , 7 , 8. die Schwierigkeit mit der hNSC Kultur, vor allem die nicht-anhaftende Neurosphäre beschrieben in diesem Protokoll ist jedoch, dass die Kultur sehr empfindlich auf die Methoden verwendet, um die Kultur9durchzuführen. Jede Änderung im Medium-Komponenten oder sogar die physische Abwicklung der das Kulturgefäß ist genug, um eine Reaktion von Zellen9zu entlocken. Um diese Probleme anzugehen, haben wir eine in-vitro- menschlichen fetalen Gehirns abgeleitet neuraler Stammzellen (hNSCs) Kultur zu mechanistisch zu befragen, die Wirkung von ZIKV auf fetale neurale Stammzellen entwickelt. Mit unserer Methode, wurden hNSCs für mehr als 80 Passagen ohne offensichtliche phänotypischen Veränderungen10beibehalten. Darüber hinaus wurden die chromosomale Veränderungen wie z. B. Trisomie entweder keine oder nur minimale11. Diese hNSC Kultur wächst als nicht-anhaftende Neurosphäre Kultur. Ein Vorteil von Neurospheres ist, dass die Kugeln eine einzigartige ökologische Nische in Kultur erstellen, die mehr reflektierende der in Vivo Nischen im Vergleich zu zweidimensionalen Kulturen9ist. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist, dass mehrere Zelltypen aus der hNSC Kultur abgeleitet werden können, ermöglichen ein Ermittler zur Beobachtung der Auswirkungen einer bestimmten Variablen auf hNSC überleben und Differenzierung. Dieses Protokoll gilt für Einzelpersonen, die Entwicklung des zentralen Nervensystems oder Dysfunktion mechanistischen Fragen. Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine hNSC Kultur um mit ZIKV zu infizieren, und anschließend unterscheiden die hNSCs zur Beobachtung der Auswirkungen einer Infektion auf den Differenzierungsprozess zu erweitern. Es enthält auch Methoden zum Speichern von hNSCs für die langfristige Nutzung und hNSCs in verschiedenen Arten von Neuronen zu unterscheiden, die weitere Untersuchung der ZIKV-induzierten Defizite zur Gehirn Fehlbildung11ermöglichen. Wir glauben, dass dieses Protokoll auch von Interesse für die Ermittler versucht, die Auswirkungen jeder ökologischen Impuls wie Infektionen oder Giftstoffe auf neurale Stammzellen überleben und Differenzierung zu verstehen ist.
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Protocol
Menschlichen neuronalen Stammzellen stammen ursprünglich aus ausrangierten menschlichen fetalen Cortexes im ersten Trimester12. Alle Protokoll-Verfahren halten an der University of Texas Medical Branch Ethikrichtlinien bezüglich der Verwendung von menschlichen Gewebeproben und die Zell-Linien wurden durch das institutionelle Biosafety Committee genehmigt.
1. mittlere Vorbereitung und Stammzellforschung Erholung der Bestände
- Bereiten Sie Kulturmedium Lager (DFHGPS) durch die Kombination der Reagenzien in Schritten 1.1.1.-1.1.5.
- 210 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium mit hoher Glucose und L-Glutamin (D) hinzugeben. Bei 4 ° c lagern.
- 70 mL Hams F12 Nährstoff-Mix mit L-Glutamin ergänzen (F) hinzugeben. Bei 4 ° c lagern.
- Fügen Sie 4,2 mL 15 mM HEPES-Puffer (H) und bei Raumtemperatur lagern.
- Fügen Sie 4,2 mL 10 % D-Glucose-Lösung (G) und bei Raumtemperatur lagern.
- Fügen Sie 2,88 mL Penicillin/Streptomycin (PS) Lösung... Aliquoten Vorratslösung in 3 mL-aliquoten und speichern die Aliquote bei-20 ° C bis benötigt.
Hinweis: Die Endkonzentration von Penicillin in das Medium werden 100 Einheiten/mL, und die Konzentration von Streptomycin werden 100 µg/mL. Dieses Medium wird für den Rest des Protokolls als DFHGPS bezeichnet werden und sollte bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1-2 Wochen gelagert werden. Bei Bedarf kann DFHGPS proportional skaliert.
- Übernachtung am Vortag Zellen werden wiederhergestellt, Mantel ein T75 Fläschchen mit 5 mL der konditionierten Medium, aus früheren Kulturen der hNSC Zelllinie gewonnen und in einem 37 ° C Inkubator mit 8,5 % Kohlendioxid (CO2 verlassen).
Hinweis: Wenn aktuell hNSCs Kultivierung, speichern Sie das Medium, das in bei einem mittleren Zellen gewachsen sind. Dies ist bedingt Medium, da es "durch die Zellen konditioniert worden ist". Konditionierten Medium kann in einem Schraubverschluss Rohr gespeichert und ca. 7 Tage bei 4 ° C gelagert werden. Wenden Sie sich an den entsprechenden Autor, um hNSCs zu erhalten. Konditionierten Medium wird bevorzugt, aber nicht zwingend erforderlich, besonders beim ersten Start der Kultur des hNSCs. - Der Tag der Erholung, 20 mL DFHGPS in einem 50 mL Schraubverschluss Rohr in ein Wasserbad von 37 ° C für mindestens 10 min warm und erst unmittelbar vor Gebrauch im Wasserbad halten.
- In einem separaten 15 mL Schraubverschluss Rohr 10 mL DFHGPS im Wasserbad 37 ° C für mindestens 10 min warm und halten Sie es in das Wasserbad bis zum Gebrauch im Schritt 1.13.
- Rufen Sie einen Behälter mit Eis und allen Mittelkomponenten (Tabelle 1). Tauen Sie alle Medium-Komponenten auf dem Eis auf und lassen Sie sie während der Vorbereitung für die mittlere Änderung auf dem Eis.
- Erhalten Sie 5 mL der konditionierten mittlere Lager (bei 4 ° C gelagert) und bewahren Sie es an einem 37 ° C Wasserbad bis zum Gebrauch im Schritt 1.14. Siehe Hinweis nach Schritt 1.2, wenn es keine bedingte Mittel- oder aktuellen menschlichen fetalen neurale Stammzellen-Kultur gibt.
- Rufen Sie 50 mL Schraubverschluss Rohr aus Schritt 1.3 ab und legen Sie sie in die Biosicherheit Kabinett (BSC). Übertragen Sie 10 mL DFHGPS in ein neues 15 mL Schraubverschluss Rohr zu, und platzieren Sie die 50 mL Tube enthält die restliche 10 mL des DFHGPS Mediums zurück in das 37 ° C-Wasserbad.
- Erhalten Sie ein Kryo-Fläschchen mit hNSCs in flüssigem Stickstoff gelagert. Siehe Hinweis nach Schritt 1.2, wenn es keine aktuellen menschlichen fetalen neuronale Stammzellen-Kultur gibt.
Hinweis: Menschlicher neuronaler Stammzellen waren ursprünglich aus ausrangierten menschlichen fetalen Gehirn12 abgeleitet und in der Kultur ohne gentechnische Veränderungen10gepflegt. 5 × 106 Zellen sollten aufgetaut und auf einem T75 Kolben beschichtet. Jedes Cryo-Fläschchen sollten 5 × 106 Zellen enthalten; Daher braucht man ein Fläschchen pro Flasche. - Tauwetter ein Fläschchen mit Zellen in 37 ° C Wasserbad durch Umdrehen der Flasche alle 10 s für ca. 1 min oder bis Eis geschmolzen ist und der Inhalt der Durchstechflasche völlig flüssig sind. Tauchen Sie das ganze Fläschchen unter Wasser zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen nicht.
- Verwenden Sie in der BSC eine P1000 Mikro-Pipette aspirieren Sie die aufgetauten Zelle Lösung und fügen Sie es tropfenweise der 15 mL Tube von Schritt 1.7, mit 10 mL DFHGPS. Die aufgetauten Zelle Lösung tropfenweise hinzufügen, drücken Sie langsam den Kolben so dass nur ein oder zwei Tropfen auf einmal freigesetzt wird. Währenddessen schwenken Sie 15 mL Schlauch um eine schnelle Mischung zu ermöglichen.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen des Überstands, und achten Sie auf die Zelle Pellet zu behalten.
- Während Schritt 1.11 Abrufen der 50 mL-Tube, die restliche 10 mL ab Schritt 1.7 enthält. Nach der Zentrifugation Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL DFHGPS und Zentrifuge wieder bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Während der letzten Spin bereiten Sie das neue Wachstumsmedium durch folgende Tabelle 1 bis 10 mL des DFHGPS Mediums über Schritt 1.4 (Tabelle 1) BSC Wachstumsfaktoren hinzufügen. Lassen Sie das neue Medium mit Wachstumsfaktoren in der BSC erst unmittelbar vor Gebrauch.
- Rufen Sie T75 Kolben aus Schritt 1.2 ab und verwerfen Sie die konditionierte Medium Beschichtung des Kolbens durch Absaugen. Fügen Sie dann die 5 mL des konditionierten Medien aus Schritt 1.6. in den Kolben mit einer serologischen Pipette. Achten Sie darauf, nicht auf der Unterseite des Kolbens zu kratzen.
- Abrufen der Röhre von Zellen aus der Zentrifuge und den Überstand durch Absaugen, die Zelle Pellet intakt zu verwerfen.
- Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 10 mL der neuen Medien aus Schritt 1.13 mithilfe einer serologischen 5-mL-Pipette und nach oben und unten mehrmals pipettieren. Fügen Sie die Aufhängung in den beschichteten T75 Kolben aus Schritt 1.14. Verwenden Sie die restliche 5 mL zu, um das Rohr zu spülen, das die Zelle Pellet enthalten, und fügen Sie dann diese 5 mL in den Kolben sowie.
- Rock den T75 Kolben hin und her 3 Mal um sicherzustellen, dass die Zellen der Kolben gleichmäßig verteilt sind. Sicherstellen Sie, dass die Kappe der Flasche ist locker, um Luftstrom zu ermöglichen. Unter einem Lichtmikroskop beobachtet die Zellen, machen Sie sich Notizen, und Bilder wenn möglich.
Hinweis: Die Zellen sollten lichtdurchlässig und kugelförmigen aussehen. Notieren gibt es Zellen, dass Blick dunkel, undurchsichtig oder asymmetrische Boarder haben, wie das Absterben von Zellen angeben kann. Achten Sie auch auf eine Pilz- oder bakterielle Kontamination, wie die Medien immer in der Farbe gelb. - Legen Sie die Flasche von Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 8,5 % CO2.
Hinweis: Verwenden Sie 8,5 % anstelle von 5,0 % CO2 pH-Wert dieser serumfreien Kultur Medien im Bereich von 7.1-7.4 zu halten.
2. hNSC mittlere Änderung
Hinweis: Ändern Sie Medium alle 3-4 Tage.
- Auf der BSC und reinigen Sie gründlich mit 70 % Ethanol. Beobachten Sie Zellen unter einem Lichtmikroskop.
Hinweis: Machen Sie sich Notizen auf das Aussehen der Zellen und Kugel Größen. Drei Tage nach Erholung oder Passage werden Zellen zusammen und beginnen, nicht anhaftende Neurosphären bilden.
Achtung: Wenn Zellen an der Unterseite der Flasche halten, müssen die Kultur verworfen werden, wie Einhaltung der Zelle vorzeitigen Differenzierung erhöht und Zellen nicht in der Lage werden, einen Stamm-Zustand zu halten. Wenn es gibt zu viele Zellen in der Küvette, die Zellen können große Kugeln (größer als 2 mm Durchmesser) in diesem Fall bilden, Zellen in der Mitte der Kugel werden beginnen, wegen des Mangels an Zugang zu den Wachstumsfaktoren im Medium zu unterscheiden. Wenn Kugeln größer als 1 mm im Durchmesser beobachtet werden, können Zellen passagiert (Schritte 3.1-3,22). - Führen Sie die Schritte 1.4 und 1.5 und 10 mL frisches Medium vorzubereiten (siehe Schritt 1,13).
- Tilt-Kolben zur Seite, so dass Kugeln an der Unterseite des Kolbens zu versenken.
- Entfernen Sie 5 mL der konditionierten Medien von der Oberseite des Mediums gebündelt mit einer serologischen 5 mL-Pipette, kümmert sich nicht um irgendwelche Neurosphären Aspirieren. Legen Sie die 5 mL des konditionierten Medien in eine saubere 15 mL-Tube.
- Eine zusätzliche 5 mL des konditionierten Medien aus der Flasche, die Kugeln wieder sorgfältig zu vermeiden und die 5 mL in der gleichen 15mL Tube.
- Die restlichen 5 mL konditionierten Medien und Zellen in den Kolben 10 mL der neuen Medien aus Schritt 2.2 hinzufügen. Legen Sie den Kolben nach unten flach und beobachten Sie Zellen unter einem Lichtmikroskop.
- Wenn sich herausstellt, dass Zellen während der Erfassung des konditionierten Medium angesaugt worden haben, drehen Sie die konditionierte Medium 100 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Wieder aussetzen Sie alle Zellen, die an der Unterseite in 1 mL der konditionierten Medium ansammeln, und fügen Sie sie in den Kultur-Kolben.
- Speichern Sie die 10 mL unbenutzt konditionierten Medien von Treppe 2.5/2.6 bei 4 ° c in einem 15 mL Schraubverschluss Rohr.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.17/1.18.
3. hNSC Passage
Hinweis: hNSCs sollte Durchgang alle 9-11 Tage wenn Zellen wachsen in der Regel als Bevölkerung Verdopplungszeit etwa 3 Tage13ist.
- Wenn die NSCs erweitert in eine neue Flasche, sicherstellen Sie, dass alle neuen Kolben wie in Schritt 1.2 beschichtet sind.
- Reinigen der BSC wie in Schritt 2.1, und führen Sie Schritte 1.4 und 1.5.
- Medium wie in Schritt 1.13 vorzubereiten. Jede Flasche T75 erfordert 10 mL Medium. Multiplizieren Sie für mehrere T75 Fläschchen 10 mL der Medien durch die Anzahl der Fläschchen.
- Bereiten Sie entweder 1 oder 3 mL Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) und Glukose und Platz im Wasserbad 37 ° C zu warm für 10 min (für Trypsin Lösung) nach Volumen in Tabelle 2. Fügen Sie zu diesem Zeitpunkt keine Trypsin oder DNase. DNase eventuell zu brechen keine DNA aus abgestorbenen Zellen durch mechanische oder chemische Zelle Dissoziation entlassen.
Hinweis: Für einen T75 Kolben nach 9-10 Tagen des Wachstums passagiert werden etwa 30 × 106 Zellen, wenn 5 × 106 ursprünglich auf den Kolben ausgesät wurden. In der Regel wird 1 mL des dPBS Lösung für 10 × 106 Zellen verwendet. Daher ist 3 mL des dPBS Lösung für ein T75 Fläschchen passagiert nach 9-10 Tagen benötigt. - Saubere kleine Ort wiegen Boot und Hemocytometer Kapuze. Mit 70 % Ethanol reinigen und trocknen an der Luft in Haube für ca. 5 Minuten.
Hinweis: Das Wiegen-Boot wird in Schritten 3.17.1 verwendet werden. - Rufen Sie den Kolben der Zellen, die wird aus dem Inkubator passagiert und bringen in der BSC. Kippen Sie Kolben vorsichtig damit Zellen sinken auf den Boden der gepoolten Medien. Es gibt etwa 15 mL Medien in die Flasche.
- Entfernen Sie etwa 10 mL Medien in 5 mL Portionen (d.h. 5 mL + 5 mL). Legen Sie diese 10 mL von Medien in eine saubere 15 mL-Tube mit der Aufschrift "CM" für "konditionierten Medium". Achten Sie darauf, dass Sie keine der Zellen, die restlichen 5 mL der Medien in der Küvette eingelebt Aspirieren; Diese Zellen und 5 mL der Medien werden Schritt 3.8 unterzogen werden.
- Nehmen Sie 3 mL des konditionierten Medien aus der Tube "CM" (aus Schritt 3,7) und legen Sie in einem 15 mL-Tube mit der Aufschrift "Trypsin-Inhibitor-Lösung". Dies wird in Schritt 3.12 verwendet werden. Nach dem Entfernen des 3 mL gibt es 7 mL konditionierten Medien Links in die Röhre "CM". Die "CM" Röhre bis 3.9 Schritt beiseite.
- Entfernen Sie 5 mL der Medien und in der Küvette T75 verbleibenden Zellen zu, und legen Sie in eine saubere 15 mL-Tube mit der Aufschrift "Zellen".
- Nehmen Sie die "CM" Röhrchen mit 7 mL konditionierten Medien (aus Schritt 3.7.1) und spülen Sie der Unterseite des Kolbens T75 zweimal mit 3,5 mL Portionen der konditionierten Medien mit einer serologischen 5 mL-Pipette. Legen Sie nach jedem spülen die 3,5 mL Portionen in die Röhre "Zellen". Dieser Schritt soll alle Neurosphären (Zellen) von der T75 Kolben entfernen.
- Zentrifugieren der "Zellen"-Rohr 100 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Während Zellen drehen, 37 ° C Wasserbad einzuholen Sie dPBS/Glukoselösung und fügen Sie die entsprechende Menge an Trypsin und DNase nach Tabelle 2.
- Nachdem die "Zellen" Röhre nicht dreht mehr hat, entfernen alle konditionierte Medium überstand und übertragen auf das Rohr "CM".
- Nehmen Sie das Rohr mit der Bezeichnung "Trypsin-Inhibitor-Lösung" aus Schritt 3.7.1. und fügen Sie das Volumen der Trypsin-Inhibitor in Tabelle 3angegeben. Verwenden Sie die gleiche Menge an Trypsin-Inhibitor-Lösung wie für die Trypsin-Lösung verwendet wurde.
- Legen Sie Trypsin Inhibitor Lösung im 37 ° C Wasserbad bis benötigt.
- Die Zelle Pellet in der 15 mL Tube Trypsin-Lösung hinzu und pipette rauf und runter ca. 5-10 Mal mit einer 5-mL-Pipette. Schließen Sie die Kappe des Rohres und im Wasserbad 37 ° C für 5 min inkubieren. Nach 5 min die Zellen abrufen und pipette rauf und runter 5-10 Mal. Dann im Wasserbad für eine zusätzliche 10-15 min 37 ° C inkubieren.
- Bewegen Sie in den letzten 5 min die Trypsin-Inhibitor-Lösung zu den BSC.
- Die Zellen abrufen, nachdem Schritt 2.14 abgeschlossen ist und pipette die Zellen oben und unten bis Kugeln vollständig dissoziiert sind (20 - 30 Mal). Fügen Sie sofort die Trypsin-Inhibitor-Lösung und Pipette nach oben und unten 10 Mal. Diese Lösung der dissoziierten Zellen und Trypsin-Inhibitor wird als "Zellsuspension" bezeichnet werden.
- Die Anzahl der Zellen in der Zellsuspension durch folgende Schritte.
- Pipette 15 µL Trypan blau Pre-Gemisch (mit 5 µL von 0,4 % Trypan blau und 10 µL des dPBS) auf einem kleinen wiegen-Boot, und fügen Sie dann 5 µL Zellsuspension. Pipette rauf und runter 3-5mal zu mischen. Dann, Pipette 10 µL Trypan blau/Zellsuspension auf beiden Seiten von einem Hemocytometer mit einem Glas Deckgläschen bedeckt.
- Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jedem der vier Ecke Netze. Fügen Sie diese Zahlen zusammen.
- Wiederholen Sie zählen für die andere Seite und Durchschnitt die beiden Seiten zusammen.
- Multiplizieren Sie diese Zahl mit 10.000, die Gesamtzahl der Zellen pro mL zu geben. Multiplizieren Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Milliliter, die Gesamtzahl der Zellen in der Zellsuspension zu berechnen. Berechnen Sie, wie viel Volumen der Zellsuspension für 5 Millionen Zellen pro T75 Kolben Saatgut benötigt werden.
Hinweis: In der Regel nach 9 bis 10 Tagen ein T75 25-30 × 106 Zellen haben. Daher ist wenn alle Zellen in neuen Flaschen Passagierung, insgesamt ca. 5-6 Fläschchen erforderlich. - Fügen Sie das Volumen der Zellsuspension in Schritt 3.19 zu jedem T75 Kolben zu 5 × 106Zellen pro Flasche berechnet. Bei der Größe von weniger als 5 mL fügen Sie Zusatzbedingung Mittel-bis zu insgesamt 5 mL zu machen hinzu. Fügen Sie 10 mL des neuen DFHGFPS Medien enthaltenden Wachstumsfaktoren (Tabelle 1) in den Kolben.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.17 und 1,18 und sicherzustellen Sie, dass die Flasche mit der Art der Zellen, die Daten, die Anzahl der Zellen in den Kolben und die Durchgangsnummer (Dies ist die Anzahl der Zeiten, die die Zellen passagiert wurden) gekennzeichnet ist. Schritte 4 bis 9 dann verschieben.
- Wenn nötig, Samen Extra in Zellen ein T75 Kolben an der Dichte bis zu 30 × 106Zellen pro Flasche über Nacht, und am nächsten Tag nach Schritt 4 einfrieren.
4. hNSC Einfrieren und Lagerung
- Am Tag nach Passagierung, Abrufen des Kolbens aus dem Inkubator, enthalten die Zellen zum Einfrieren (aus Schritt 3.19 und 3,22). Neigen Sie die Flasche und entfernen Sie alle Mittel und Zellen aus der Flasche und in der 15 mL Tube. Dann Zentrifugieren Sie das Rohr auf 216 X g für 5 min.
- Bereiten Sie bei der Zentrifugation Einfrieren Medium (Tabelle 4). Alle 5 × 10 Vorbereitung6 Zellen 1 mL Einfrieren Medium. Die Anzahl der Zellen wurde im Schritt 3.19 ermittelt, wie viele Zellen in jedem Kolben setzen bei der Festlegung. Diese Nummer wird nicht über Nacht geändert haben.
- Cryo-Konserve Fläschchen mit Etiketten Zellnamen, Passagenanzahl, Zellzahl, Initialen und Datum vorzubereiten. Entfernen Sie nach Zentrifugation Überstand durch Aspiration und wieder auszusetzen Sie Zelle Pellet in Medium Einfrieren, so dass es 5 × 106 Zellen/mL gibt. Mit einer 5 mL-Pipette, aliquoten 1 mL pro Fläschchen und Dichtung fest (5 × 106 Zellen pro Fläschchen).
- Fläschchen in einem Cryo-Konserve Behälter mit 250 mL Isopropanol (max. Nutzung von 5-Mal pro Ersatz von Isopropanol) zu platzieren. -80 ° C Gefrierschrank lagern über Nacht, und übertragen Sie dann mit einem flüssigen Stickstoff-Tank-Speichersystem.
5. Beschichtung anhaftende hNSC zur Validierung
- Am Vortag Passagierung (Schritte 3.1-3,22), reinigen die BSC wie in Schritt 2.2 und ein 24-Well-Platte und sterile Glasdeckgläser 12 mm.
- Mit Pinzette, einem einzigen Deckgläschen auf den Boden von jedem Bohrloch der Platte legen.
- Bestreichen Sie die Brunnen mit Deckel rutscht mit 0,01 % Poly-D-Lysin (PDL) in sterilem Wasser und 1 h bei 37 ° c inkubieren. Verwenden Sie für eine 24-Well-Platte 250 μL der PDL pro Bohrloch.
- Die PDL von den Brunnen zu entfernen, und dann Mantel mit 1 µg/cm2 Laminin/dPBS (250 μL pro Well). Die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren Wenn nicht am nächsten Tag die Dichtplatte mit Parafilm durch Umwickeln der Parafilm an den Rändern der Platte und Lagerung bei 4 ° C.
Hinweis: Platten beschichtet mit Laminin können bis zu 2 Wochen gelagert werden wenn mit Parafilm versiegelt, solange Deckel rutscht nicht trocken. - Durchgang-Zellen als beschrieben Schritte 3.1-3.22, und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die Samen in der 24-Well-Platte mit beschichteter Deckgläsern.
- Entfernen Sie jede überschüssige Laminin-Lösung aus Brunnen durch Aspiration und spülen Sie einmal mit 0,5 mL des dPBS. Dann Samen Sie Zellen in die Vertiefungen bei einer Dichte von 0,6-1 x 105 Zellen/cm2 pro Bohrloch. Verwenden Sie verbleibenden Zellen entsprechend Schritte 3.16-3.21.
- Atvarious Zeiten während der 24-Well-Platte-Kultur, reparieren und färben die Zellen für verschiedene Stammzell-Marker nach Schritt 9.
(6) Grundierung, GABA und Glutamat Nervenzellen zu erhalten
- Durchgang der Zellen wie unter 3.1-3.22, und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die Samen in einer 24-Well-Platte wie in Schritt 5.6.
- Bereiten Sie am Vortag Grundierung, den Deckel rutscht und Mantel Platte wie in 5.1-5.4 beschrieben.
- Priming Tag abgerufen Sie werden die Kolben mit 2-3-Tages-Zellen. Legen Sie in einem 15 mL-Tube und pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 100 X g für 5 Minuten.
- Bereiten Sie das epidermalen Wachstumsfaktor/Leukämie hemmenden Faktor/Laminin (ELL) Grundierung Medium gemäß Tabelle 5.
- Zellen mit ELL Medium aufzuwirbeln.
- Samen ausgesetzt Zellen in einer 24-Well-Platte (folgen Schritt 5.6).
7. Grundierung zu motorischen Neuronen
- Führen Sie die Schritte 6.1-6.4.
- Bereiten Sie das grundlegende Fibroblasten Wachstumsfaktor/Heparin/Laminin (FHL) Grundierung Medium gemäß Tabelle 6.
- Folgen Sie Schritt 5.6.
8. Zika-Virus Infektion
Hinweis: ZIKV ist sehr empfindlich auf Temperatur, so ist es unerlässlich, die ZIKV Lager-80 ° C und Einfrieren/Auftauen Zyklen gespeichert sind werden vermieden. Arbeiten Sie weiter Aliquote auf Eis.
- Durchgang Zellen wie in 3.1-3.22 beschrieben. 3 Millionen Zellen insgesamt sind erforderlich, um eine 24-Well-Platte daher Saatgut, wenn Passagierung, legen Sie die Anzahl der Zellen für Infektion benötigt und säen in einem Kolben bei Passagierung.
- Wenn Zellen in einer 24-Well-Platte für das Beflecken Aussaat, bereiten Sie die Deckgläsern und Platte entsprechend Schritte 5.1-5.4.
- Legen Sie nach Passagierung, 1 mL Zellsuspension vom Schritt 8.2 in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand durch Absaugen.
- Aufschwemmen Sie Pellet aus Schritt 8.3 ZIKV vorrätig, eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von entweder 1 bis 10 zu erwerben. Das Volumen der ZIKV Lösung sollte 0,5 mL nicht überschreiten. Mock Behandlung (Kontrollzellen) Aufschwemmen Sie Zellen in der gleichen Lautstärke und Art des Mediums im ZIKV Lager verwendet.
Hinweis: ZIKV Stoffaufbereitung und Infektion sind in einer früheren Publikation11aufgeführt. Mock-Infektionen sind auch mit Medium durchgeführt. - Inkubieren Sie über Zelle/ZIKV Mischung bei 37 ° C, 1H invertieren das Rohr 2 - 3 Mal und anschließend Zentrifugieren Mischung für 5 min bei 216 X g bei Raumtemperatur zu einer Zelle Pellet. Aufschwemmen Sie Pellet in dPBS und Zentrifuge wieder für 5 min bei 216 X g bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, Aufschwemmen Sie Zellen mit geeigneten Medium und laden Sie infizierte Zellen in Kolben oder Platte für das Experiment benötigt. Wenn die Zellen in einer 24-Well-Platte Aussaat Aufschwemmen Sie das Pellet in 12 mL des entsprechenden Mediums, und fügen Sie 500 μL der Aussetzung in jede Vertiefung.
Hinweis: an dieser Stelle erhalten die Zellen im Wachstumsmedium Auswirkungen von ZIKV auf Stammzellen beobachten oder gehen zu den Schritten 6 oder 7, die Wirkung des ZIKV auf den Differenzierungsprozess zu studieren.
9. Färbeverfahren
- Um die Zellen zu beheben, entfernen Sie Medium, einmal mit 0,5 mL pro Bohrloch (24-Well-Platte) Eis kalt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) spülen.
- PBS, und Zellen mit 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd in PBS zu decken und lassen bei Raumtemperatur für 20-30 min.
- Entfernen Sie die Paraformaldehyd und spülen Sie Zellen dreimal mit 0,5 mL PBS, verlassen die dritte PBS spülen auf 10 min bei Raumtemperatur.
- An dieser Stelle lassen Sie die PBS über Nacht einwirken und lagern Sie die Platte bei 4 ° c oder beginnen Sie Färbung nach 10 min spülen.
- Nach 10 min. PBS spülen, blockieren die Zellen für 45-60 min in einer stationären Position mit 0,5 mL Lösung von 5 % normalem Ziegenserum (NGS), 0,3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,25 % Triton x-100 in Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS). Zum Beispiel, um 1 mL Lösung Verwendung zu blockieren: 10 µL 25 % Triton x-100, 50 µL 100 % NGS und 100 µL 3 % BSA gemischt in 840 µL des TBS.
- Während der Sperrung Schritt bereiten Sie die Primärantikörper Lösung, dafür, dass alle Reagenzien auf Eis gehalten werden. Zur Validierung von hNSCs, können Proteine wie Nestin ausgerichtet sein, unter Verwendung des entsprechenden Antikörpers gegen sie. Um ZIKV Infektion zu überprüfen, verwenden Sie einen Antikörper gegen ZIKV Mantel Protein11. Zur Differenzierung verwenden Sie Markierungen wie Klasse III β-Tubulin um zu neuronale Populationen zu identifizieren, während glial fibrillary sauren Protein (GFAP) zur Identifizierung Astrozyten verwendet werden kann. Die Konzentrationen der primären Antikörper sind je nach Anbieter und Menge empirisch bestimmt. Wir haben die meisten Antikörper von 1: 100 bis 1: 2000-Verdünnung verwendet.
- Zentrifugieren Sie den primären Antikörper bei 12.000 x g für 2 min bei 4 ° C, und stellen Sie dann eine Verdünnung; z. B. um eine 1: 1000 Verdünnung der Antikörper bilden, addieren 7.2 µL des gewünschten Antikörper in 7,2 mL von 0,25 % Triton x-100 in TBS.
- Jede Vertiefung einer 24-Well-Platte ca. 300 µL Antikörper-Lösung hinzu, und inkubieren Sie die Zellen mit dem Primärantikörper in einer stationären Position für 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° c über Nacht in einer stationären Position.
- Waschen Sie nach der Inkubation Zellen mit 0,5 mL TBS dreimal bei Raumtemperatur für 10 min in einer stationären Position.
- Der Sekundärantikörper bei 12.000 x g für 2 min bei 4 ° C zentrifugiert, dann in 0,25 % Triton X-100/TBS Lösung verdünnen. Machen Sie genügend Antikörperlösung jedes gut 300 µL hinzu. Hier, verdünnen Sie die fluoreszierenden Sekundärantikörper 1: 500 (Abbildung 3).
- Nachdem die letzte TBS waschen, jedes gut 300 µL der Sekundärantikörper Lösung hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln für 1 h bei Raumtemperatur in einer stationären Position. Ab diesem Zeitpunkt müssen alle Schritte in einem dunklen Raum stattfinden.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit TBS für 10 min in einer stationären Position.
- Während der letzten 10 min waschen Verdünnen des nuklearen Markers DAPI nuklearen Fleck auf der empfohlenen Konzentration in TBS (in der Regel 1:1,000 - 1:5, 000). Machen Sie genug Lösung jedes gut 300 µL hinzu.
- Nach der letzten Wäsche jedes gut 300 µL DAPI-Lösung hinzu und 5 min bei Raumtemperatur in einer stationären Position inkubieren. Waschen Sie anschließend einmal mit 0,5 mL TBS.
- Verwenden Sie ein Anti-Fade Eindeckmedium für Fluoreszenz und 1 Tropfen (10-15 µL) pro Deckglas, der auf der Folie platziert wird. Benutzen Sie eine Pinzette sorgfältig entfernen Deckgläsern aus den 24-Well-Platte-Brunnen und der Zelloberfläche nach unten auf das mittlere Drop-Montage auf der Folie.
- Sobald die Deckgläsern auf der Folie platziert sind, legen Sie die Folie in einen flachen Diahalter. Achten Sie darauf, Label Folien werden alle relevanten Informationen erforderlich, um die Zellen auf der Folie zu identifizieren, dann decken den Halter mit Alu-Folie Folien vor Licht geschützt zu halten.
- Speichern der Folien bei 4 ° c und ermöglichen das Eindeckmittel über Nacht zu festigen. Am nächsten Tag beobachten die Folie mit einem Epifluorescent Mikroskop mit UVC-2E/Filter (340-380 nm), GFP HYQ BP Filter (450-490 nm) oder Y-2E/C Texas Rotfilter (540-580 nm), 20 X Vergrößerung.
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Representative Results
Kultivierte hNSCs in der Proliferativen Phase wird als nicht-anhaftende Neurosphären (Abbildung 1) wachsen. Unmittelbar nach der hNSC Passage werden viele einzelne Zellen, welche aggregiert werden und beginnen, Form Kugeln in den nächsten Tagen (Abb. 1A und 1 b). Gesunde Sphären sollte etwa 1-2 mm Durchmesser 9-10 Tage nach einer Passage (Abbildung 1). Kugeln, die größer als 2 mm werden ein dunkles Zentrum entwickeln und die Wachstumsfaktoren im Medium werden nicht in der Lage, die Zellen in der Mitte der Kugel, was zu unerwünschten Differenzierung zu erreichen. Gesunde Sphären erscheint transluzent und Pseudo-Cilien an den Rändern der Kugel (Abbildung 1) angezeigt.
Galvanik Neurosphären auf eine anhaftende Oberfläche Färbung Zwecken führt das Wachstum der anhaftende Sphären (Abbildung 2A). Diese Kugeln werden die Oberfläche Kulturgefäß berühren und haben einige Projektionen erstreckt sich auf der Oberfläche des Behälters, unter Beibehaltung einer zentralen Kugel (Abb. 2A). Grundierung und Differenzierung der Zellen benötigen die Zellen an einem Deckglas am unteren Rand eine Zellplatte Kultur, z. B. einer 24-Well-Platte halten. Im Anschluss an die entsprechende Grundierung Schritte und Zugabe von Differenzierung Medium werden die Zellen über die Oberfläche des das Kulturgefäß ausbreiten und wachsen als miteinander verbundene Monolage von Zellen (Abb. 2 b).
Um die Gültigkeit der hNSC Kultur oder Phänotyp von differenzierten Zellen entweder zu bestätigen, kann fluoreszierende Immunohistochemistry verwendet werden. Nestin ist ein Zwischenprodukt Heizfaden normalerweise ausgedrückt in NSCs und kann verwendet werden, um die hNSC Kultur (Abbildung 3A) zu überprüfen. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Neuronen nach Differenzierung, kann in der Regel Klasse III β-Tubulin Label Neuronen (Abb. 3 b) verwendet werden. Obwohl der Priming-Schritt verwendet wird, um einen höheren Prozentsatz von Neuronen nach Differenzierung zu erreichen, werden es weiterhin Astrozyten in der Kultur. Glial fibrillary sauren protein (GFAP) dient zur Label Astrozyten um zu quantifizieren, wie viel Prozent von differenzierten Zellen Astrozyten und Neuronen wurde.
Wir fanden, dass die K048 Linie der NSCs von afrikanischen und asiatischen Stämmen von ZIKV von immunofluorescent Färbung mit einem spezifischen ZIKV Antikörper erkannt infiziert war. Die repräsentative Bilder sind in Abbildung 4dargestellt. Mock-Infektion eine Änderung der hNSC Morphologie oder überleben (Abbildung 4A, 4 C) nicht entlocken. ZIKV neigt dazu, in den Randbereich einer infizierten Zelle eines Tages Post eine 1-stündige Infektion bleiben, sondern füllt die ganze Zelle 3 bis 7 Tage (Abbildung 4 b4D, 4E). Spürbar, mit der selben MOI (0,1), eine geschätzte 5 % Infektionsrate in K048 Zellen ist deutlich niedriger als diejenigen kürzlich ZIKV berichtete Infektion rate (bis zu 80 %) in menschliche Haut-induzierte NSCs7. Diese Studie, Berichterstattung 80 % Infektiosität, verwendete den Prototyp afrikanischen Stamm der ZIKV (MR766), die einen neurotropic Phänotyp bei über 140 Passagen in den Gehirnzellen Maus angepasst haben kann.
Abbildung 1: Hellfeld Bilder der Kultur hNSC. (A-C) Repräsentative Hellfeld Aufnahmen mit 10-facher Vergrößerung der hNSC Kultur 1, 4 und 9 Tage nach Passagierung, beziehungsweise. Skalieren Sie Bars: 60 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Hellfeld Bilder von anhaftenden Kulturen. (A) repräsentative Hellfeld Aufnahmen bei 10 X Vergrößerung von anhaftenden hNSC Kultur, 7 Tage nach der Beschichtung. (B) repräsentativen Hellfeld-Aufnahmen mit 10-facher Vergrößerung der Anhänger differenzierte Zellen nach ELL Grundierung und 9 Tagen der Differenzierung. Skalieren Sie Bars: 60 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: fluoreszierende Bilder von hNSCs und differenzierte Kulturen. (A) repräsentative fluoreszierende Aufnahmen mit 20 X Vergrößerung von anhaftenden hNSCs gebeizt mit Stammzell-Marker Nestin , DAPI (blau) und nukleare Marker (rot). Maßstabsleiste: 60 µm (B) repräsentative fluoreszierende Aufnahmen bei 60 X Vergrößerung von differenzierten Zellen befleckt mit neuronalen Marker βIII-Tubulin (grün), Astrozyten Maker GFAP (rot) und nukleare Marker DAPI (blau). Skalieren Sie Bars: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: ZIKV Infektion in der menschlichen fetalen Gehirns stammenden NSCs. Menschliche NSCs wurden entweder Mock behandelt (A und C), geimpft für 1 Stunde mit einer afrikanischen Abstammung Stamm von ZIKV bei MOI von 0,1 (B und D) oder mit einer asiatischen Stamm von ZIKV, die vor kurzem von Moskitos in Mexiko im Jahr 2016 (E) isoliert. Immunofluorescent Färbung erkennt, Kennzeichnung von ZIKV Antikörpern im NSCs auf ein bis sieben Tage Post Impfung (1 dpi in B, 7dpi in D und 3 dpi in E). Skala 10 µm-bars in A-D und 5 µm in E. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| DFHGPS Medien für eine T75 | 10 mL |
| ZAHLUNGSDIENSTLEISTERN * | 173 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 50 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin ** | 25 ΜL |
| 20 µg/mL epidermalen Wachstumsfaktor | 10 ΜL |
| 20 µg/mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor | 10 ΜL |
| Leukämie-Inhibitor Faktor 10 µg/mL | 10 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 10 ΜL |
| * Mischung mit 100 µg/mL Transferrin, 100 µM Putresine, 20 nM Progesteron und 30 nM Natriumselenit. Die Mischung besteht aus konzentrierten Bestände und Aliquote sind bei-80 ° C gelagert und innerhalb von 6 Wochen Vorbereitung preferablly verwendet. Die konzentrierten Bestände sind 10 mg/mL Transferrin, 30 mM Putrescin, 10 µM Progesteron und 15 µM Natriumselenit bei-80 ° c gelagert. | |
| ** Insulin wird aufgelöst in 0,01 N hydroen Chlorid, durch 0,2 µM eiweißarme Bindungsfilter gefiltert und für bis zu 6 Wochen bei 4 ° c gelagert. | |
Tabelle 1: Wachstumsfaktoren für neue Verbreitung Medium.
| dPBS * | 1 mLeiner | 3 mLb |
| 10 % Glukose | 60 ΜL | 180 ΜL |
| 2,5 % Trypsin | 10 ΜL | 30 ΜL |
| DNAse ** | 5 ΜL | 15 ΜL |
| * Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung | ||
| ** Deoxyribonuclease | ||
| eine für 10 Millionen Zellen | ||
| b für 30 Millionen Zellen | ||
Tabelle 2: Vorbereitung von Trypsin.
| Konditionierte Medien | 1 mLeiner | 3 mLb |
| Trypsin-Inhibitor | 10 ΜL | 30 ΜL |
| eine für 10 Millionen Zellen | ||
| b für 30 Millionen Zellen |
Tabelle 3: Vorbereitung der Trypsin-Inhibitor.
| DFHGPS * | 0,7 mLein | 2,1 mLb |
| FBS ** 20 % | 0,2 mL | 0,6 mL |
| DMSO *** 10 % | 0,1 mL | 0,3 mL |
| * DMEM, F12, HEPES, Glukose, Penicillin-streptomycin | ||
| ** Fötalen Rinderserum | ||
| Dimethyl Sulfoxid | ||
| eine für 5 Millionen Zellen in einer Durchstechflasche | ||
| b für drei Vials, 5 Millionen Zellen/vial | ||
Tabelle 4: Vorbereitung der eisigen Medium.
| DFGHPS * für einen Brunnen in einer 24-Well-Platte | 1 mL |
| ZAHLUNGSDIENSTLEISTERN ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2.5 ΜL |
| 20 µg/mL epidermalen Wachstumsfaktor | 1 ΜL |
| 10 µg/mL Leukämie hemmenden Faktor | 1 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Enthält DMEM, F12, HEPES, Glukose, Penicillin-streptomycin | |
| ** Enthält 100 µg/mL Transferrin, 100 µM Putresine, | |
| 20 nM Progesteron und 30 nM Natriumselenit | |
Tabelle 5: Vorbereitung der ELL Priming Medium.
| DFGHPS * für einen Brunnen in einer 24-Well-Platte | 1 mL |
| ZAHLUNGSDIENSTLEISTERN ** | 17.3 ΜL |
| 200 mM L-Glutamin | 5 ΜL |
| 10 mg/mL Insulin | 2.5 ΜL |
| 20 µg/mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor | 0,5 ΜL |
| 5 mg/mL Heparin | 0,5 ΜL |
| 1 mg/mL Laminin | 1 ΜL |
| * Enthält DMEM, F12, HEPES, Glukose, Penicillin-streptomycin | |
| ** Enthält 100 µg/mL Transferrin, 100 µM Putresine, | |
| 20 nM Progesteron und 30 nM Natriumselenit | |
Tabelle 6: Vorbereitung der FHL Priming Medium.
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Discussion
Die Möglichkeit, Kultur und manipulieren hNSCs stellt ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Zwecken von Modellierung menschlichen Krankheit, Drogen Hochdurchsatz-screening-10,11,12,14verwendet werden kann, 15,16,17. Viele Fragen blieben wie wie menschlichen fetalen Gehirns NSCs angegangen werden oder deren Nachkommen sind anfällig für ZIKV Infektion, ob verschiedene Stämme von ZIKV NSCs mit gleicher Effizienz infizieren und Mikrozephalie wie Infektion während der neuronalen Entwicklung ergibt. Wir haben diese hNSC Kultur verwendet, um Zika Virus verbundenen Neuropathologie11,14zu untersuchen. Mithilfe von drei Stämme von Zellen isoliert von drei einzelnen Spendern können wir auch individuelle Unterschiede, Anfälligkeit für die neurologische Defizite beobachteten folgende ZIKV Infektion11zu vergleichen. Eine Einschränkung dieser Technik ist die Zugänglichkeit zu hNSC Proben und dem konditionierten Medium Voraussetzung für richtige Kultur. Um dieses Hindernis zu umgehen, kontaktieren Sie bitte den entsprechenden Autor um einen materiellen Transfer zu arrangieren, da die Zellen in diesem Protokoll verwendeten nicht kommerziell verfügbar sind.
In-vitro- Studien mit hNSCs nicht nur einzigartige Einblicke in grundlegende Stammzellen Verhalten, sie bieten auch eine hervorragende Plattform um präklinische Forschung zu betreiben. Allerdings können die technischen Herausforderungen der Kultivierung hNSCs als Hindernis im Umgang mit ihnen als effektive und reproduzierbare Modelle dienen. In diesem Protokoll haben wir skizziert die wichtigsten Schritte und Methoden, die können verwendet werden, um die Variabilität in der Kultivierung Methoden zu reduzieren und eine gesundes und stabiles hNSC Stammzelle-Kultur. Ein Nachteil bei der Verwendung hNSC Neurosphäre Kultur ist, dass die Zellen extrem empfindlich auf alle Reize sind. Auch ist das ausführliche Protokoll oben es wichtig, genau darauf achten, wieviel Flaschen oder Gerichte der hNSCs behandelt werden, da die subtilsten Variationen über das Protokoll zu Änderungen im Neurosphäre Verhalten führen können.
Der wichtigste Teil dieses Methodenpapiers ist der Cocktail von Wachstumsfaktoren und Vorbereitung der verschiedenen Medien. Wenn die Verdopplungszeit der hNSC Kultur sehr niedrig ist oder viele Zellen Adherie, das Kulturgefäß (wenn sie nicht haftend sein sollte), der erste Schritt besteht darin, dass die Wachstumsfaktoren verwendet wird die entsprechende Konzentration sind und nicht abgelaufen ist. Alle Wachstumsfaktoren in diesem Protokoll haben eine sehr kurze Haltbarkeit einmal aufgetaut (5-6 Tage). Darüber hinaus haben wir Wachstumsfaktoren aus mehreren Unternehmen genutzt und bemerkt die Unterschiede in der Qualität und Konzentration erforderlich, um die Kultur zu erhalten. Daher empfehlen wir die genaue Wachstumsfaktoren in der Materialtabelledetailliert. Der passaging Schritt (Schritt 3.1-3.22) ist auch eine häufige Fehlerquelle. Wenn es viele Tote Zellen, die nach dem Verfahren der Dissoziation gibt, reduzieren Sie die Anzahl der Wiederholungen der Pipettieren rauf und runter um die Zellen zu trennen, da zu viel körperliche Dissoziation Zelltod führen kann. Alternativ gibt es viele Gruppen von Zellen nach der Dissoziation Schritt, Steigerung der Vitalität oder Anzahl der Zeiten der Pipettieren rauf und runter, als diese Cluster wird schnell werden große Kugeln, die nicht in der Kultur lebensfähig bleiben werden. Wenn die Kultur richtig gepflegt wird, ist die Infektion mit ZIKV relativ einfach.
Während ZIKV Infektion die Behandlung detailliert in diesem Protokoll ist, ist es möglich, dieses hNSC-Kultur-System für eine Vielzahl von Studien zu verwenden. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, Drogen, individuelle Anfälligkeit zu untersuchen, und eine Vielzahl von Krankheiten und Entwicklungsstörungen14zu Grunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Dieses System ist auch ideal für genomische Studien, da die kultivierten Zellen nicht genetisch manipuliert und wenig bis keine Chromosomenanomalien, sogar bis zu 80 Passagen10,11 zeigen. Wir glauben, dass dieses Kultursystem ideal für die Modellierung in Vitro wie Reize aus der Umwelt wie Infektionen, Medikamente, Alkohol, Toxine, etc. können Einfluss auf die Entwicklung des Nervensystems.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde mit Mitteln der John S. Dunn Foundation und das Institut für menschliche Infektion und Immunität von der University of Texas Medical Branch (PW) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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