Zika Virus infektion af kulturperler menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til andre analyse
Summary
I denne artikel beskrives de metoder, der bruges til at udvide menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller i kultur, samt hvordan at differentiere dem i forskellige neuronal undertyper og astrocytter, med en vægt på brugen af neurale stamceller til at studere Zika virusinfektion.
Abstract
Menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller er et unikt ikke-genetisk modificerede modelsystem at studere virkningerne af forskellige stimuli på menneskelige udviklingsmæssige neurobiologi. Snarere end benytter en dyremodel eller genetisk modificerede inducerede pluripotente celler, giver humane neurale stamceller en effektiv in vitro- system for at undersøge virkningerne af behandlinger, skærmen narkotika, eller undersøge individuelle forskelle. Her, leverer vi detaljerede protokoller for metoder, der anvendes til at udvide menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller i kultur med serumfrit-medier, at differentiere dem i forskellige neuronal undertyper og astrocytter via forskellige priming procedurer, og at fryse og inddrive disse celler. Desuden, vi beskriver en procedure for at bruge menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til at studere Zika virusinfektion.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en flavivirus overføres seksuelt, eller af myg vektorer Aedes aegypti og Aedes albopictus myg. ZIKV blev for nylig udpeget som en trussel mod alvorlige folkesundheden på grund af sin brugervenlighed transmission og tilknyttede neurologiske symptomer1. En af mest vedrørende neurologiske effekter er udviklingen af microcephalus i fostre født til inficerede gravide2,3. Microcephalus er en neurologiske udvikling lidelse, hvor hovedet er mindre end den typiske størrelse under fosterudviklingen og ved fødslen, med omkreds er mindre end 2 standardafvigelser under den gennemsnitlige4. Den mindre hovedomkreds er ofte ledsaget af en bred vifte af co-morbiditet udviklingsmæssige forsinkelser, anfald, vision og høretab og fodring problemer.
Nylige undersøgelser har brugt dyremodeller eller induceret pluripotente stamceller til at studere effekten af ZIKV infektion på nervesystemets udvikling5,6,7,8. Mens disse undersøgelser har bidraget til vores viden om ZIKV, brug af forskellige arter eller genetisk modificerede celler kan være tidskrævende og/eller tilføje yderligere variabler, der kan forvirre effekten af ZIKV på celler udvikling af neurale5, 6 , 7 , 8. vanskeligheder med hNSC kultur, især ikke-tilhænger neurosphere kultur beskrevet i denne protokol, er imidlertid, at kulturen er meget følsomme over for de metoder, der anvendes til at gennemføre kultur9. Enhver ændring i mellemstore komponenter, eller endog den fysiske håndtering af kultur fartøj, er nok til at fremkalde en reaktion fra celler9. For at løse disse problemer, udviklet vi en in vitro- humane fostrets hjerne-afledte neurale stamceller (hNSCs) kultur at mekanisk afhøre effekten af ZIKV på føtal neurale stamceller. Bruge vores metode, blev hNSCs opretholdt i over 80 passager uden tilsyneladende fænotypiske forandringer10. Derudover kromosomale ændringer som trisomi var enten ingen eller minimal11. Denne hNSC kultur vokser som en ikke-tilhænger neurosphere kultur. En fordel ved neurospheres er, at områderne skabe en unik miljømæssige niche i kultur, der er mere reflekterende i vivo nicher i forhold til to-dimensionelle kulturer9. En anden fordel ved denne protokol er, at flere celletyper kan være afledt fra hNSC kulturen, muliggør en investigator at observere effekten af en given variabel på hNSC overlevelse og differentiering. Denne protokol finder anvendelse på personer, der søger for at besvare mekanistiske spørgsmål vedrørende udvikling af centralnervesystemet eller dysfunktion. Følgende protokol beskriver hvordan du kan udvide en hNSC kultur for at inficere med ZIKV, og efterfølgende differentiere hNSCs for at observere virkningen af infektion på differentiering proces. Det omfatter også metoder til at gemme hNSCs for langvarige skik og differentiere hNSCs i forskellige typer for neuroner, der tillader yderligere undersøgelse af ZIKV-induceret underskud bidrager til hjernen misdannelse11. Vi mener, at denne protokol er også af interesse for efterforskere forsøger at forstå konsekvenserne af eventuelle miljømæssige stimuli som infektion eller toksiner på neurale stamceller overlevelse og differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evnen til at kultur og manipulere hNSCs giver et kritisk værktøj, der kan bruges til mange forskellige formål fra modellering menneskelig sygdom at høj overførselshastighed stof screening10,11,12,14, 15,16,17. Mange spørgsmål forblev for at blive behandlet som hvordan menneskelige fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra John S. Dunn Foundation og Institut for Human infektioner og immunitet af University of Texas Medical gren (P.W.).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
