Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique
Summary
Cet article décrit les méthodes qui sont utilisés pour étendre le cerveau foetal humain des cellules souches neurales dans la culture, ainsi que comment les différencier en divers sous-types neuronales et les astrocytes, en mettant l’accent sur l’utilisation des cellules souches neurales pour étudier l’infection par le virus Zika.
Abstract
Cerveau foetal humain des cellules souches neurales sont un système unique de modèle non génétiquement modifié pour étudier l’impact de divers stimuli sur la neurobiologie du développement humaine. Plutôt que d’utiliser un modèle animal ou cellules pluripotentes induites génétiquement modifiés, des cellules souches neurales humaines constituent un système efficace in vitro pour examiner les effets des traitements, médicaments de l’écran, ou examiner les différences individuelles. Ici, nous fournissons les protocoles détaillés pour les méthodes utilisées pour développer des cellules souches neurales de cerveau foetal humain en culture et médias sans sérum, pour différencier dans divers sous-types neuronales et les astrocytes via des procédures différentes d’amorçage, geler et récupérer ces cellules. En outre, nous décrivons une procédure d’utilisation de cellules souches neurales de cerveau foetal humain pour étudier l’infection par le virus Zika.
Introduction
Zika virus (ZIKV) est un flavivirus transmis sexuellement ou par les moustiques Aedes aegypti et Aedes albopictus moustique vecteur. ZIKV a été récemment identifié comme une menace grave de santé publique en raison de sa facilité de transmission et affiliés ainsi qu’avec des symptômes neurologiques1. Un des plus concernant les effets neurologiques est le développement d’une microcéphalie chez les foetus nés de mères infectées enceintes2,3. Microcéphalie est un trouble neurologique du développement où la tête est plus petite que la taille typique pendant le développement du foetus et à la naissance, dont la circonférence est inférieure à 2 écarts-types au-dessous de la moyenne4. Le plus petit tour de tête est généralement accompagné d’une variété de maladies concomitantes telles que les retards de développement, saisies, vision et perte d’audition et difficultés d’alimentation.
Des études récentes ont utilisé des modèles animaux ou induite par les cellules souches pluripotentes pour étudier l’effet de l’infection à ZIKV sur le développement neurologique5,6,7,8. Alors que ces études ont contribué à notre connaissance de ZIKV, l’utilisation d’espèces différentes ou de cellules génétiquement modifiées peuvent être beaucoup de temps et/ou ajouter des variables supplémentaires qui peuvent entraîner l’effet du ZIKV sur le développement neuronal cellules5, 6 , 7 , 8. Toutefois, la difficulté avec la culture de HNS, particulièrement la culture non adhérents Neurosphère décrite dans le présent protocole, est que la culture est très sensible aux méthodes utilisées pour mener la culture9. Tout changement de composants moyens, ou encore la manipulation physique du navire la culture, est suffisant pour déclencher une réaction de la cellules9. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé une culture in vitro humain foetal encéphales cellules souches neurales (hNSCs) pour interroger mécaniquement l’effet du ZIKV sur les cellules souches neuronales foetales. En utilisant notre méthode, hNSCs ont été maintenues pendant plus de 80 passages sans changements phénotypiques apparent10. En outre, des altérations chromosomiques comme la trisomie n’ont aucun ou un minimum de11. Cette culture de HNS se développe comme une culture Neurosphère non adhérents. Un avantage de neurospheres est que les sphères créent une niche environnementale unique dans la culture qui reflète plus en vivo niches par rapport aux cultures deux dimensions9. Un autre avantage de ce protocole est que plusieurs types de cellules peuvent provenir de la culture de la HNS, permettant à un enquêteur d’observer l’impact d’une variable donnée sur HNS survie et la différenciation. Le présent protocole est applicable aux personnes qui cherchent à répondre à des questions mécanistiques concernant le développement du système nerveux central ou un dysfonctionnement. Le protocole suivant décrit comment développer une culture de HNS pour infecter avec ZIKV et par la suite se différencient la hNSCs pour observer l’impact de l’infection sur le processus de différenciation. Il inclut également des méthodes pour stocker hNSCs pour une utilisation à long terme et pour hNSCs se différencient en divers types de neurones qui permettent une investigation des déficits induite par le ZIKV contribuant au cerveau malformation11. Nous croyons que ce protocole est également d’intérêt pour les enquêteurs qui cherchent à comprendre l’impact de tout stimulus environnementaux tels que l’infection ou de toxines sur les cellules souches neurales de survie et la différenciation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de la culture et de manipuler des hNSCs fournit un outil essentiel qui peut être utilisé pour une variété de fins de modélisation des maladies humaines à drogue haut débit préalable10,11,12,14, 15,16,17. Beaucoup de questions restée à traiter comme le cerveau foetal h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de le S. John Dunn Foundation et l’Institut des infections chez l’homme et de l’immunité de l’University of Texas Medical Branch (P.W.).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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