平坦化された哺乳類の皮質皮質モジュールの可視化
Summary
この記事では、哺乳類の皮質から接線方向の平坦化されたセクションを取得し、皮質モジュールによる組織化学的および免疫組織化学的方法を視覚化する詳細な方法について説明します。
Abstract
哺乳類の大脳皮質は異なる部分やモジュールに parcellated です。皮質モジュールは通常そこに皮質のシートを平行し特定の組織化学的および免疫組織化学的方法で線引きすることができます。この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離し、皮質のシートに平行にセクションを取得するそれらを平坦化する方法を強調表示します。さらに、組織化学的選択したハイライト、これらを処理する免疫組織化学的方法は、皮質モジュールを可視化する接線方向のセクションを平坦化します。各種哺乳動物の体性感覚皮質では、体表や動物の体のさまざまな部分を表す皮質モジュールを明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学的研究を実行します。内側内嗅領皮質、グリッド セルの生成場所、領域は皮質のシートにグリッド パターンのいくつかの種の間で整理される遺伝のニューロンのモジュールを強調表示する免疫組織化学的方法を駆使します。全体的にみて、分離し、layer-wise を準備するためのフレームワーク皮質のセクションを平坦化、化学を用いた皮質モジュールとさまざまな哺乳類の脳での免疫組織化学的方法を視覚化を提供いたします。
Introduction
大脳皮質における系統間の頭脳の構造の最も重要な変更のいくつかを観察できます。重要な違いにもかかわらず動物の大脳皮質共通パターンに従います、レイヤーとエリア1では 2 つの異なる方法で大きく分類されます。皮質層はそこに脳の表面に平行と哺乳類の皮質1で 6 層に爬虫類野2の 3 レイヤーの数が異なります。皮質は一方で主など個別の機能に対応する大脳皮質の異なる領域、体性感覚野はタッチや視覚入力の処理の視覚皮質の感覚に関与します。これらの皮質頻繁に分割できますパッチまたはモジュール3、解剖学的構造は、基本的に脳の軟膜の表面に平行を見つけては繰り返し定期的にします。皮質モジュールが特定のレイヤー4に限られることがあります。 またはいくつかのレイヤー5に 。
脳の標準断面方法は、コロナや矢のような脳の表面に正常のセクションを含みます。皮質モジュールを可視化するこれらのメソッドを使用できますが、皮質のモジュールは、脳の表面に平行な平面で接線方向、視覚化されたときは、興味深い機能の多くを明らかになることができます。例えば、脳表面に垂直に視覚化されたときバレルとしてひげを表す齧歯動物の脳の体性感覚のモジュールが表示され、従って地域派生名バレル皮質。ただし、接線方向にバレルの視覚化の彼らは外部の体表面のひげの正確なレイアウトをミラーリング地形向きで配置されてバレルとウィスカ マップを明らかに。特定のケースでモジュール式の配置はかなりの期間のための検出をエスケープも非接線方法で視覚化されたとき。内側嗅は、グリッド セル、動物が環境を走査するとき規則的な六角形パターンで発射するニューロンの存在を知られています。にもかかわらず、最近では、パッチの有無や内側嗅細胞のモジュールまで大きく調査エリアは、6の六角形のパターンでレイアウトする物理的に検出を逃れていた。プレゼンスおよびラット脳におけるこれらのモジュールの配置は、内側嗅の接線方向のセクションを作ると、細胞構築を層ごとに調査によって促進されました。
断面後、皮質モジュールの可視化の特定の側面は、複数の方法で実現できます。従来、研究細胞密度や繊維レイアウト1に基づいてモジュールの輪郭を描いた。高い活動8の領域を明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学を使用する人気のある方法です。新しいアプローチは、遺伝的に決定細胞型のタンパク質発現プロファイル6,8に基づいて区別を見ています。
この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離、平面的な接線方向のセクションを取得およびチトクロム酸化酵素組織化学および細胞型特定の蛋白質の免疫組織化学に基づいて大脳皮質のモジュールを可視化する方法を強調表示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
大脳皮質のモジュールは、さまざまな技術を使用して識別されています。早いいずれかの可視化による研究通常識別される皮質モジュール セルの密集した地域または繊維1の不在。それ以降のメソッドは、有無樹状束24、25の特定の領域からの求心性神経の神経伝達物質26の充実に活用しています。ここで 2 つの技術、(i) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、神経変性疾患 (DZNE) は、ドイツ連邦教育省および研究 (BMBF、Förderkennzeichen の zu ベルリンのフンボルト大学, 計算の神経科学のベルリンのための Bernstein の中心, ドイツ語センターによって支えられました。01GQ1001A)、NeuroCure とゴットフリート ・ ヴィルヘルム ・ ライプニッツ賞 DFG。優れたグラフィック デザインの平石山とユリアーネ Diederichs の優秀なテクニカル サポートに感謝します
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
