Визуализация корковых модулей в плоский млекопитающих коре
Summary
Эта статья описывает подробная методология для получения уплощенных секции касательной от млекопитающих коре и визуализировать корковых модули, используя гистохимические и иммуногистохимических методов.
Abstract
Коры мозга млекопитающих является parcellated в отдельных подструктур или модулей. Корковых модули обычно размещаются параллельно корковых лист и могут быть определены некоторые гистохимические и иммуногистохимических методов. В этом исследовании мы выделить метод, чтобы изолировать коры от млекопитающих мозги и придавить их для получения разделы параллельно корковых лист. Мы далее выделить выбран гистохимические и Иммуногистохимические методы для обработки этих уплощенная тангенциальная разделы для визуализации корковых модулей. В соматосенсорной коры различных млекопитающих мы выполняем цитохрома оксидазы гистохимии раскрыть карты тела или корковые модулей, представляющих различные части тела животного. В медиальной entorhinal коры, области, где создаются ячейки сетки, мы используем иммуногистохимических методов для выделения модулей генетически детерминированных нейронов, которые расположены в сетке в таблице корковых через несколько видов. В целом мы предоставляем рамки для изоляции и подготовить layer-wise плоский корковых участков и визуализировать корковых модули, используя гистохимические и иммуногистохимических методов в широкий спектр млекопитающих мозги.
Introduction
Некоторые из наиболее значительных изменений в структуре мозга через филогении можно наблюдать в коре. Несмотря на существенные различия коры животных общей схеме и может быть широко разделены двумя разными способами, слои и области1. Кортикального слоя лежат параллельно поверхности головного мозга и различаются в номер из 3 слоев в рептилиям коре2 6 слоев в млекопитающих коре1. С другой стороны корковых областях коры отдельных регионов, которые в основном соответствуют различных функций, например, соматосенсорной коры участвует в ощущение касания или зрительной коры в обработке визуальных материалов. Эти корковых областях часто подразделяются3патчи или модули, которые регулярно повторяем анатомические структуры, по существу нашли параллельно сетчаточных поверхности головного мозга. Корковых модулей может ограничиваться конкретной слой4, или продлить через несколько слоев5.
Стандартные секущей методы мозга включают разделы, нормальное к поверхности головного мозга, как коронковой или сагиттальной. В то время как эти методы могут использоваться для визуализации корковых модули, множество интересных особенностей могут быть выявлены при кортикальной модули визуализируются вскользь, в плоскости, параллельной поверхности головного мозга. Например соматосенсорные модули в грызунов мозга, представляющие усы, появляются как баррелей когда визуализирована нормали к поверхности мозга, и таким образом регионы получают имя ствол коры. Однако на визуализации баррелей в касательной ориентации, они показывают столбик карта, с бочки изложены в топографических ориентации зеркального отображения точное расположение усы на поверхности внешней тела. В некоторых случаях, Модульная композиция даже избежал обнаружения на значительные периоды, когда визуализирована в не тангенциальные манере. Медиальный entorhinal коры, известен за наличие сетки клеток, нейронов, которые огонь в шаблоне регулярного гексагональной, когда животное обход среды. Несмотря на то, что это сильно исследованной площади, до недавно, наличие пятен или модули клеток в медиальной entorhinal коры, которые физически располагаются в гексагональной шаблон6, бежал обнаружения. Наличие и расположение этих модулей, в мозге крыс, способствовали, сделав тангенциальная разделы медиальный entorhinal коры и расследования cytoarchitecture послойного образом.
После разрезания, конкретный аспект визуализации корковых модулей также может быть реализована несколькими способами. Классически исследования очерчены модулей на основе клеток плотность или волокна макет1. Еще один популярный подход является использование цитохрома оксидазы гистохимии, который показывает области выше деятельности8. Новые подходы включают в себя глядя на типы генетически детерминированных клеток, различие на основе их белков выражение профили6,8.
В этом исследовании мы подчеркиваем методы изолировать коры от млекопитающих мозги, получить плоский тангенциальная секций и визуализировать корковых модулей на основе гистохимии цитохрома оксидазы и иммуногистохимии камерного типа специфических белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модульность в коре была определена с использованием различных методов. Ранние исследования обычно определены корковых модули, либо визуализации ячейки плотной регионы, или отсутствие волокна1. Последующие методы использовали присутствие дендритных связки24,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Humboldt Universität цу Берлин, Бернстайн центр вычислительной нейронауки Берлин, Немецкий центр для нейродегенеративных заболеваний (DZNE), немецкого федерального министерства образования и научных исследований (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure и Готфрид Вильгельм Лейбниц приз DFG. Мы благодарим Симпэй Исияма для превосходный графический дизайн и Juliane Diederichs отличные технической помощи.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
