Visualização de módulos corticais em córtices mamíferos achatadas
Summary
Este artigo descreve uma metodologia detalhada para obter secções tangenciais achatadas de mamíferos córtices e Visualizar módulos corticais usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica.
Abstract
O córtex do cérebro dos mamíferos é parcellated em subestruturas distintas ou módulos. Módulos corticais normalmente mentem paralelos à folha cortical e podem ser delineados por certos métodos histoquímicos e imuno-histoquímica. Neste estudo, destaca-se um método para isolar o córtex do cérebro de mamíferos e achate-os para obter paralelo de seções para a folha de cortical. Nós ainda mais destaque selecionado histochemical e métodos de imuno-histoquímica para processar estas achatada tangenciais seções para visualizar módulos corticais. No córtex somatossensorial de vários mamíferos, realizamos a citocromo oxidase histoquímica para revelar o corpo mapas ou módulos corticais que representam diferentes partes do corpo do animal. No córtex entorhinal medial, uma área onde as células da grade são geradas, utilizamos métodos de imuno-histoquímica para destacar os módulos de neurônios geneticamente determinados, que estão dispostos em um padrão de grade na planilha de cortical através de várias espécies. No geral, nós fornecemos um quadro para isolar e preparar layer-wise achatado seções corticais e visualize corticais módulos usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica em uma ampla variedade de cérebros de mamíferos.
Introduction
Algumas das alterações mais significativas na estrutura do cérebro através de filogenia podem ser observadas no córtex cerebral. Apesar de diferenças significativas, o córtex dos animais segue um padrão comum e pode ser dividido em duas maneiras distintas, por camadas e áreas1. Camadas corticais mentem paralelas à superfície do cérebro e variam em número de 3 camadas em reptiliano córtices2 a 6 camadas em mamíferos córtices1. Áreas corticais, por outro lado, são regiões distintas do córtex, que em grande parte correspondem às funcionalidades distintas, por exemplo, o córtex somatossensorial está envolvido com a sensação de toque ou o córtex visual no processamento visuais entradas. Estas áreas corticais podem muitas vezes ser subdivididas em patches ou módulos3, que são regularmente repetindo estruturas anatômicas, encontradas essencialmente paralelas à superfície pial do cérebro. Módulos corticais podem ser confinados a uma determinada camada4ou estendem através de várias camadas5.
Métodos de corte padrão do cérebro envolvem seções normais à superfície do cérebro, como coronal ou sagital. Enquanto estes métodos podem ser usados para visualizar os módulos corticais, uma multiplicidade de características interessantes pode ser revelada quando os módulos corticais são visualizados tangencialmente, em um plano paralelo à superfície do cérebro. Por exemplo, módulos somatossensorial do cérebro de roedor representando bigodes, aparecem como barris quando visualizado normal à superfície do cérebro, e, portanto, as regiões derivam o córtex de barril de nome. No entanto, na visualização dos barris em uma orientação tangencial, eles revelam whisker-mapa, com os barris sendo colocados para fora em uma orientação topográfica espelhamento o layout dos bigodes na superfície externa do corpo. Em certos casos, o arranjo modular escapou mesmo deteção por períodos consideráveis, quando visualizado de forma não-tangencial. O córtex entorhinal medial, é conhecida pela presença de grade de células, neurônios que dispara em um padrão hexagonal regular quando um animal está atravessando um ambiente. Mesmo que seja uma área fortemente investigada, até recentemente, a presença de manchas ou módulos de células no córtex entorhinal medial, que fisicamente são dispostas em um padrão hexagonal6, tinha escapado a deteção. A presença e a disposição destes módulos, em cérebro de ratos, foi facilitada pela fazendo seções tangenciais do córtex entorhinal medial e investigar a cytoarchitecture de forma layer-wise.
Logo após o corte, o aspecto particular de visualização de módulos corticais também pode ser realizado de várias formas. Classicamente, os estudos foram delineados módulos baseados em célula densidade ou fibra layout1. Outra abordagem popular é o uso da histoquímica de citocromo oxidase, que revela as áreas de maior atividade8. Abordagens mais recentes incluem a olhar para os tipos de células geneticamente determinada, distinguidos-se com base em sua proteína expressão perfis6,8.
Neste estudo, destaca-se métodos para isolar o córtex do cérebro de mamíferos, obter secções tangenciais achatadas e Visualizar corticais módulos baseados em citocromo oxidase histoquímica e imuno-histoquímica das proteínas específicas do tipo de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modularidade no córtex cerebral foi identificada usando uma variedade de técnicas. Os primeiros estudos normalmente identificados cortical módulos ou visualizando célula regiões densas, ou uma ausência de fibras1. Utilizaram-se métodos subsequentes a presença de feixes dendríticas24, afferents de uma determinada região25, ou enriquecimento de neurotransmissores26. Aqui vamos demonstrar duas técnicas, coloração (ii…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Humboldt-Universität zu Berlin, o centro de Bernstein para Berlim de neurociência computacional, o centro alemão para doenças neurodegenerativas (DZNE), o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure e a Gottfried Wilhelm Leibniz prêmio da DFG. Agradecemos Shimpei Ishiyama para design gráfico excelente e Juliane Diederichs para assistência técnica excelente.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
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