I dette papir give vi oplysninger om metoder til produktion og kontrol med kvaliteten af en IL4-10 rekombinant fusion protein. Vi viser også hvordan du kan teste effektiviteten af dette protein til at løse smerte i en musemodel af inflammatorisk smerte.
Kroniske smerter er vanskelige at behandle og nye tilgange til at løse vedvarende smerter er tvingende nødvendigt. Anti-inflammatoriske cytokiner er lovende kandidater til behandling af invaliderende smerte betingelser på grund af deres evne til at regulere afvigende neuro-immune interaktioner. Men de arbejder fysiologisk i et netværk af forskellige cytokiner, og derfor deres terapeutiske virkning kan ikke være optimalt, når det bruges som stand-alone narkotika. For at overvinde denne begrænsning har udviklet vi en fusion protein af den anti-inflammatoriske cytokiner IL4 og IL10. Her, vi beskriver metoder til produktion og kvalitetskontrol af IL4-10 rekombinant fusion protein og vi teste effektiviteten af IL4-10 fusion protein til at løse smerte i en musemodel af vedvarende inflammatorisk smerte.
Kroniske smerter er fortsat en af de mest invaliderende og under-behandlede medicinske problemer af 21, der påvirker > 20% af den voksne befolkning1,2. Dog, behandlinger til at give lindring fra kroniske smerter er ofte ineffektive eller skal afbrydes på grund af alvorlige bivirkninger3. Vigtigere, i øjeblikket tilgængelige lægemidler kun giver symptomlindring, men ikke i væsentlig grad ændre eller helbrede kroniske smerter. Selv om kroniske smerter synes at være en neurologisk lidelse, tyder inddragelse af immunsystemet i kroniske smerter udvikling4,5. Derudover immun-baserede tilgange til behandling af smerter er ved at opstå. For eksempel, hæmmer anti-inflammatoriske cytokiner smerte i flere modeller af kroniske smerter6,7,8. Dog, anti-inflammatoriske cytokiner har en kort halveringstid, mindske deres smerte-hæmmende virkninger. Desuden, anti-inflammatoriske cytokiner fungerer mest optimalt i koncert med hinanden. For at overvinde disse begrænsninger, smeltet vi for nylig anti-inflammatoriske cytokiner interleukin-4 (IL4) og interleukin-10 (IL10) ind i et molekyle. IL4-10 fusion protein viser overlegne effektivitet i at hæmme kroniske inflammatoriske og neuropatiske smerter i forhold til den enkelte cytokiner9. Vi beskrive her hvordan sådan fusion protein er produceret, renset, og hvordan dens kvalitet er kontrolleret.
IL4-10 fusion protein er produceret i humane celler af forbigående Transfektion af HEK293-F celler med en pUPE udtryk vektor transporterer cDNA sekvensen kodning IL4-10 fusion protein. HEK293-F celler er valgt at tillade posttranslationel modifikation af protein, noget, der ikke forekommer i bakteriel udtryk systemer. For at optimere glycan loft med sialic syre, cDNA kodning beta-galactoside-2, er 3-sialyl-transferase indarbejdet i vektoren som en anden transgenet. Fusion protein er renset ved hjælp af affinitet protein oprensning af supernatanten kultur, fordi det er mere kraftfuld end rensning af andre metoder f.eks. størrelse-udelukkelse eller ionbytning kromatografi10,11. For at rense IL4-10 fusion protein, brugte vi in-house lavet monoklonale antistoffer mod IL4. Vurdering af renhed og bioactivity af renset IL4-10 fusion protein er udført som en del af kvalitetskontrol. Renheden af fremstillede batcher er evalueret af Sodium Dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og høj pres størrelse udstødelse kromatografi (HP-sek). Bioactivity af IL4-10 fusion protein vurderes ved at måle dens evne til at hæmme LPS (LPS)-induceret tumor nekrose faktor-alfa (TNFα) produktionen i fuldblod kulturer, og sammenligne det til kombinationen af enkelt cytokiner.
Endelig, for at teste IL4-10 fusion proteiner evne til at hæmme kroniske smerter, beskriver vi, hvordan fusion protein kan testes som smertestillende i udbredte musemodeller af vedvarende inflammatorisk smerte12,13,14 . Her beskriver vi metoderne af en inflammatorisk smerte model. Det er dog vigtigt at bemærke, at andre smerte modeller kan være brugt (fxneuropatiske smerter modeller), afhængigt af forskningen spørgsmål der skal besvares. For at vurdere smerte i disse modeller, er det vigtigt at bruge en række adfærdsmæssige foranstaltninger, der omfatter fremkaldt og ikke-fremkaldte smerter. Her, beskrev vi metoderne til vurdering af ændringer i mekanisk og termisk evoked adfærdsmæssige reaktioner. Mekanisk følsomhed til uskadelige stimuli er vurderet ved hjælp af Von Frey test, mens termisk følsomhed vurderes ved hjælp af Hargreaves test. Vigtigere, er ikke-fremkaldte hyperalgesia/allodyni målt ved hjælp af dynamisk vægt leje test. Disse foranstaltninger er bredt accepteret som smerte foranstaltninger og give vigtige oplysninger om smertegrænser og potentielle smerter opleves af dyr15,16,17. Andre foranstaltninger for at vurdere ikke fremkaldte smerter (fx, stimulus uafhængige), såsom konditioneret sted præference test, kan være værdifulde18. For at vurdere potentialet af stoffet til at hæmme smerte, udførte vi Intratekal administration af fusion protein, som med denne administrationsvej mindre protein dosis er nødvendig for at nå smerte-relaterede områder og undgå systemiske (side-) effekt19, 20.
Dette manuskript beskriver metoder til produktion og karakterisering af en rekombinant IL4-10 fusion protein, og metoder til at teste dens effektivitet i at hæmme inflammatorisk hyperalgesia i musemodeller af vedvarende inflammatorisk smerte. Produktion og oprensning af IL4-10 fusion protein er udført på en lille skala. HEK293 celler er valgt som et udtryk for protein produktion, fordi de aktiverer posttranslationelle modifikationer, der ikke kan opnås i prokaryote udtryk systemer. Posttranslationelle modifikationer …
The authors have nothing to disclose.
En del af dette arbejde har været finansieret af et Utrecht Universitet Det Biovidenskabelige yde
FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |