Développement de protéines recombinantes pour traiter la douleur chronique
Summary
Dans cet article nous fournir des détails pour les méthodes de production et de contrôle de la qualité d’une protéine de fusion recombinantes IL4-10. Nous montrons aussi comment tester l’efficacité de cette protéine afin de résoudre la douleur dans un modèle murin de la douleur inflammatoire.
Abstract
La douleur chronique est difficile à traiter et de nouvelles approches pour résoudre la douleur persistante sont urgent. Cytokines anti-inflammatoires sont prometteurs pour le traitement débilitantes de douleur en raison de leur capacité à réguler les interactions neuro-immunitaire aberrantes. Cependant, physiologiquement, ils travaillent en réseau de diverses cytokines, et donc leur effet thérapeutique est peut-être pas optimale lorsqu’il est utilisé comme drogue autonome. Pour contourner cette limitation, nous avons mis au point une protéine de fusion des cytokines anti-inflammatoires IL4 et IL10. Ici, nous décrivons les méthodes de production et de contrôle de la qualité de la protéine de fusion recombinantes IL4-10 et nous avons testé l’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 afin de résoudre la douleur dans un modèle murin de la douleur inflammatoire persistante.
Introduction
La douleur chronique demeure l’un des problèmes médicaux les plus débilitantes et mal traitée du XXIe siècle, affectant > 20 % de la population adulte1,2. Cependant, les traitements pour fournir le soulagement de la douleur chronique sont souvent inefficaces ou doivent être interrompues en raison des effets secondaires graves3. Ce qui est important, actuellement médicaments disponibles seulement apporter un soulagement symptomatique, mais ne pas sensiblement modifier ou guérir la douleur chronique. Bien que la douleur chronique semble être un trouble neurologique, preuves suggère l’implication du système immunitaire dans la douleur chronique développement4,5. En outre, les approches axées sur les immunitaire pour traiter la douleur font leur apparition. Par exemple, des cytokines anti-inflammatoires empêchent la douleur en plusieurs modèles de douleur chronique6,7,8. Cependant, les cytokines anti-inflammatoires ont une demi-vie courte, en réduisant leurs effets potentiels inhibant la douleur. Par ailleurs, des cytokines anti-inflammatoires fonctionne de manière plus optimale de concert avec les autres. Pour surmonter ces limitations, nous avons fusionné récemment l’interleukine-4 de cytokines anti-inflammatoires (IL4) et l’interleukine-10 (IL10) dans une molécule. La protéine de fusion IL4-10 montre une efficacité supérieure dans l’inhibition de la douleur inflammatoire et neuropathique chronique par rapport à l’ individuel cytokines9. Ici nous décrivons comment ces protéines de fusion est produit, purifié, et comment sa qualité est contrôlée.
Protéine de fusion IL4-10 est produite dans les cellules humaines par transfection transitoire des cellules HEK293-F avec un vecteur d’expression de pUPE transportant la séquence d’ADNc codant la protéine de fusion IL4-10. Les cellules HEK293-F sont choisis pour permettre une modification post-traductionnelle de la protéine, quelque chose qui ne se produit pas dans les systèmes d’expression bactérienne. Afin d’optimiser le glycane couvrant avec l’acide sialique, ADNc codant la beta-galactoside-2, 3-sialyl-transférase est incorporée dans le vecteur comme un transgène deuxième. La protéine de fusion est purifiée à l’aide de purification de protéines d’affinité de surnageant de la culture, parce qu’il est plus puissant que la purification par d’autres méthodes par exemple exclusion stérique ou l’échange d’ions chromatographie10,11. Pour purifier la protéine de fusion IL4-10, nous avons utilisé des anticorps monoclonaux en interne contre IL4. Évaluation de la pureté et la bioactivité de la protéine de fusion purifiée IL4-10 sont effectuées dans le cadre de contrôle de la qualité. La pureté des produits lots est évaluée sur Gel de Polyacrylamide de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS-PAGE) et la chromatographie d’Exclusion taille haute pression (HP-SEC). La bioactivité de la protéine de fusion IL4-10 est évaluée en mesurant sa capacité à inhiber les lipopolysaccharides (LPS)-induit la production de facteur de nécrose tumorale-alpha (TNFα) dans les cultures de sang total et en le comparant à la combinaison de l’individu cytokines.
Enfin, afin de tester la capacité des protéines de fusion IL4-10 pour inhiber la douleur chronique, nous décrivons comment la protéine de fusion peut être testée comme analgésique dans les modèles murins largement utilisé de la douleur inflammatoire persistante12,13,14 . Nous décrivons ici les méthodes d’un modèle de douleur inflammatoire. Cependant, il est important de noter que les autres modèles de la douleur peut être utilisé (par exemple, les modèles de douleur neuropathique), selon les recherches des questions qui doivent recevoir une réponse. Pour évaluer la douleur dans ces modèles, il est important d’utiliser une variété de mesures comportementales qui incluent évoquées et non évoquée par la douleur. Ici, nous avons décrit les méthodes d’évaluation des changements dans les réponses comportementales induites mécaniquement et thermiquement. Mécanique sensibilité aux stimuli inoffensifs est évaluée en utilisant le critère de Von Frey, tandis que la sensibilité thermique est évaluée au moyen de l’essai de Hargreaves. Ce qui est important, non évoquée par hyperalgésie/allodynie est mesuré par le test dynamique portant le poids. Ces mesures sont largement considérées comme des mesures de la douleur et donnent des informations importantes sur les seuils de douleur et de douleur potentielle subis par les animaux15,16,17. D’autres mesures visant à évaluer non évoquée par la douleur (par exemple, stimulation indépendante), tels que le test de préférence de place conditionnée, peut être précieuse18. Pour évaluer le potentiel de la drogue pour inhiber la douleur, nous avons effectué l’administration intrathécale de la protéine de fusion, comme avec cette voie d’administration moins dose de protéine est nécessaire pour atteindre les zones liées à la douleur et éviter les effets systémiques (côté-)19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit des méthodes pour la production et la caractérisation d’une recombinaison protéine de fusion IL4-10 et les méthodes pour tester son efficacité pour inhiber l’hyperalgésie inflammatoire dans des modèles murins de la douleur inflammatoire persistante. La production et la purification de la protéine de fusion IL4-10 s’effectue à petite échelle. Les cellules HEK293 sont sélectionnés comme un système d’expression pour la production de protéines car elles permettent des modifications …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partie de ce travail a été financé par un Utrecht University Life Sciences accorder
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
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