פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני
Summary
במאמר זה אנו מספקים פרטים עבור שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון רקומביננטי פיוז’ן IL4-10. אנו גם מראים כיצד לבחון את היעילות של חלבון זה כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאבים דלקתיים.
Abstract
כאב כרוני קשה לטיפול, גישות חדשות כדי לפתור כאב מתמשך נחוצים בדחיפות. ציטוקינים אנטי דלקתיות הם מועמדים מבטיחים לטיפול במצבים מתישה כאב בשל יכולת שלהם להסדיר אינטראקציות נוירו-החיסון חריגה. עם זאת, מבחינה פיזיולוגית הם עובדים ברשת של ציטוקינים שונים, ולכן האפקט הטיפולי שלהם לא יכול להיות אופטימלית בשימוש כטיפול עצמאי סמים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו חלבון פיוז’ן של ציטוקינים אנטי דלקתיות IL4 ו IL10. כאן, אנו מתארים את שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון כימרי רקומביננטי IL4-10, נוכל לבחון את היעילות של החלבון פיוז’ן IL4-10 כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאב דלקתי מתמשך.
Introduction
כאב כרוני נותרה אחד ביותר מתישה, שטופלו תחת בעיות רפואיות של המאה ה-21, המשפיעים על > 20% של אוכלוסיית הבוגרים1,2. עם זאת, טיפולים כדי לספק הקלה מכאב כרוני לעיתים קרובות אינם יעילים או צריך להיות הופסק בשל תופעות לוואי חמורות3. חשוב, כיום סמים זמינים רק לספק הקלה סימפטומטי, אבל לא באופן משמעותי לשנות או לרפא כאב כרוני. למרות כאב כרוני נראה הפרעה נוירולוגית, הראיות עולה מעורבות של מערכת החיסון כאב כרוני פיתוח4,5. יתר על כן, מתגלים גישות החיסון לטיפול בכאב. לדוגמה, לעכב ציטוקינים אנטי דלקתיות כאבים במספר דגמים של כאב כרוני-6,–7,–8. אולם, ציטוקינים אנטי דלקתיות יש תוחלת חיים קצרה, הפחתת תופעות כאב עיכוב האפשריות שלהם. יתר על כן, ציטוקינים אנטי דלקתי עובדים ביותר בצורה אופטימלית בתיאום אחד עם השני. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנחנו לאחרונה התמזגו ציטוקינים אנטי דלקתיות אינטרלוקין-4 (IL4) של אינטרלוקין-10 (IL10) לתוך מולקולה אחת. חלבון כימרי IL4-10 מראה יעילות מעולה עיכוב כאב דלקתיות, נוירופטי כרוני לעומת ציטוקינים בודדים9. כאן נתאר כיצד מופק חלבון כימרי כזה, מטוהרים, ונשלט איך האיכות שלה.
חלבון כימרי IL4-10 מיוצר בתאי אדם על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK293-F עם וקטור ביטוי pUPE נושאת את רצף cDNA קידוד החלבון פיוז’ן IL4-10. HEK293-F תאים נבחרים כדי לאפשר שינוי post-translational של החלבון, משהו אינה מתרחשת במערכות חיידקי הביטוי. כדי למטב את glycan מיצוי בחומצה sialic, cDNA קידוד בטא-galactoside-2, 3-sialyl-טרנספראז משולב וקטור כמו transgene השני. החלבון פיוז’ן מטוהר באמצעות זיקה טיהור חלבון של התרבות supernatant כי זה חזק יותר טיהור על ידי שיטות למשל גודל-הדרה או יונים כרומטוגרפיה10,11אחרים. לטהר את חלבון כימרי IL4-10, השתמשנו נוגדנים חד-שבטיים תוצרת הבית נגד IL4. הערכה של טוהר, bioactivity של חלבון כימרי IL4-10 מטוהרים מבוצעת כחלק של בקרת איכות. הטוהר של אצוות המיוצר מוערך על-ידי נתרן Dodecyl סולפט לזיהוי בג’ל (מרחביות-עמוד) ו גבוהה בלחץ גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (HP-שניות). Bioactivity של החלבון פיוז’ן IL4-10 מוערך על-ידי מדידת את יכולתו לעכב ליפופוליסכריד (LPS)-induced הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNFα) ייצור בתרבויות דם מלא, והשוואה בין שהיא השילוב של הפרט ציטוקינים.
לבסוף, על מנת לבדוק את היכולת של IL4-10 היתוך חלבונים כדי לעכב כאב כרוני, נתאר איך ניתן לבחון את חלבון כימרי כמו כאבים במודלים של העכבר בשימוש נרחב של כאב דלקתי מתמשך12,13,14 . כאן נתאר את השיטות של מודל כאבים דלקתיים. עם זאת, חשוב לציין כי מודלים אחרים הכאב יכול להיות משומש (למשל, כאב נוירופתי מודלים), בהתאם למחקר שאלות שצריך לענות. כדי להעריך קוץ מודלים אלה, חשוב להשתמש במגוון אמצעים התנהגותיים הכוללים עורר ואמצעים שאינם עורר הכאב. כאן, אנחנו תיאר שיטות הערכה לקראת שינויים באופן מכני, תרמית עורר תגובות התנהגותיות. מכני רגישות לגירויים לא מזיק מוערך באמצעות מבחן פון פריי, תוך רגישות תרמית מוערך באמצעות מבחן הארגריבס. חשוב, hyperalgesia/allodynia-עורר נמדד באמצעות מבחן נושאת משקל דינמי. אמצעים אלה מקובל כמידות כאב, תשואות מידע חשוב על סף כאב וכאב פוטנציאליים מנוסים על ידי בעלי חיים15,16,17. השני מודד להערכת שאינם עורר הכאב (למשל, גירוי עצמאית), כגון הבחינה העדפה המקום ממוזגים, יכול להיות בעל ערך18. כדי להעריך את הפוטנציאל של הסם כדי לעכב את הכאב, ביצענו במחלה הניהול של החלבון פיוז’ן, עם מסלול מינהל פחות חלבון במינון הדרוש כדי להגיע לאזורים הקשורות כאב ולהימנע מערכתית (לוואי) אפקטים19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר שיטות ייצור, אפיון של חלבון חלבון כימרי IL4-10, ושיטות לבדיקת יעילותה של עיכוב hyperalgesia דלקתיות במודלים של העכבר של כאב דלקתי מתמשך. הייצור ואת טיהור של החלבון פיוז’ן IL4-10 מתבצע בקנה מידה קטן. HEK293 תאים נבחרים כמערכת ביטוי לייצור חלבון כי הם מאפשרים שינויים post-translational זה אינה יכולה ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חלק מעבודה זו ממומן על ידי מדעי החיים אוניברסיטת אוטרכט הענק
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. . Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund’s Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
