만성 통증 치료에 재조합 단백질의 개발
Summary
이 문서에서 우리는 생산 방법과 IL4-10 재조합 융합 단백질의 품질 관리에 대 한 세부 정보를 제공합니다. 우리는 또한 마우스 모델 염증 성 통증의 고통을 해결 하기 위해이 단백질의 효과 테스트 하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
만성 통증은 치료 하기 어려운 고 지속적인 통증을 해결 하기 위해 새로운 접근은 급하다. 항 염증 성 cytokines 탈 신경-면역 상호 작용을 규제 하는 그들의 능력 때문에 쇠 약하게 고통을 조건 치료를 위한 유망한 후보자 이다. 그러나, 그들은 다양 한 cytokines의 네트워크에서 작동 하는 순수 하 고 따라서 그들의 치료 효과가 독립 실행형 약물으로 사용 될 때 최적의 않을 수 있습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 우리 IL4와 IL10 항 염증 성 cytokines의 융해 단백질을 개발 했다. 여기, 우리는 생산 및 IL4-10 재조합 융합 단백질의 품질 관리에 대 한 방법을 설명 하 고 우리 마우스 모델 지속적인 염증 성 통증의 고통을 해결 하기 위해 IL4-10 융해 단백질의 효과 테스트.
Introduction
만성 통증 중 가장 쇠 약하게 하 고 아래 취급 의료 문제는 21 세기의 유지에 영향을 미치는 > 성인 인구1,2의 20%. 그러나, 만성 통증에서 구호를 제공 하는 치료는 종종 효과적인 또는 심각한 부작용3때문에 중단 해야 합니다. 중요 한 것은, 현재 사용 가능한 약물만 징후 기복을 제공 하지만 하지 크게 수정 하거나 만성 통증 치료. 비록 만성 통증 신경 장애로 나타납니다, 증거의 만성 통증 개발4,5의 면역 체계의 참여를 제안 합니다. 또한, 통증 치료에 면역-기반 접근 등장 하고있다. 예를 들어 항 염증 성 cytokines 만성 통증6,,78의 여러 모델에 통증 억제. 그러나, 항 염증 성 cytokines 짧은 반감기, 그들의 잠재적인 통증 억제 효과 줄이고 있다. 또한, 항 염증 성 cytokines 서로 콘서트에서 가장 최적으로 작동합니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 최근에 융합 항 염증 성 cytokines 인터 루 킨-4 (IL4)와 인터 루 킨-10 (IL10) 한 분자에. IL4-10 퓨전 단백질 개별 cytokines9에 비해 만성 염증 및 neuropathic 고통 억제에 탁월한 효능을 보여줍니다. 여기 우리가 이러한 융합 단백질을 생산 하는 방법 정화, 및 기술의 품질을 제어 하는 방법은.
IL4-10 퓨전 단백질 운반 IL4-10 융해 단백질을 코딩 하는 cDNA 순서 pUPE 식 벡터와 F HEK293 세포의 과도 transfection에 의해 인간의 세포에서 생산 됩니다. F HEK293 세포 단백질, 세균성 식 시스템에서 발생 하지 않습니다 뭔가의 포스트 번역 상 수정에 대 한 수를 선택 합니다. Glycan sialic 산, 베타-galactoside-2, 코딩 하는 cDNA 상한 최적화 3 sialyl 전이 효소는 두 번째 transgene로 벡터에 통합 됩니다. 융해 단백질 다른 방법 예: 크기-배제 또는 이온 교환 크로마토그래피10,11정화 보다 더 강력 하기 때문에 표면에 뜨는 문화의 선호도 단백질 정화를 사용 하 여을 정화 이다. IL4-10 퓨전 단백질 정화, 우리는 사내 만든된 IL4에 대 한 단일 클론 항 체를 사용 합니다. 순도의 평가 및 정화 IL4-10 융해 단백질의 bioactivity 품질 관리의 일환으로 수행 됩니다. 생산된 배치의 순도 나트륨 라우릴 황산 염의 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 높은 압력 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의해 평가 됩니다. IL4-10 융해 단백질의 bioactivity lipopolysaccharide (LPS)를 억제 하는 능력을 측정 하 여 평가-전체 혈액 문화에서 종양 괴 사 인자-알파 (TNFα) 생산을 유도 하 고 개인의 조합에 그것을 비교 하는 것은 cytokines입니다.
마지막으로, 만성 통증을 억제 하기 위해 IL4-10 융해 단백질의 용량을 테스트 하려면 우리 설명 어떻게 융합 단백질 지속적인 염증 성 통증12,13,14의 널리 사용된 마우스 모델에서 진통제로 시험 될 수 있다 . 여기는 염증 성 통증 모델의 방법에 설명합니다. 그러나, 그것은 다른 통증 모델 사용 (예를 들어, neuropathic 고통 모델) 수, 연구에 따라 답변 필요 질문 중요. 이러한 모델에 통증을 평가 하기 위해 다양 한 행동을 포함 하는 갖는 측정값과 갖는 비 통증 측정을 사용 하 여 중요 하다. 여기, 우리 기계적 및 열적으로 갖는 행동 응답에 변화에 대 한 평가의 방법을 설명합니다. 무해 한 자극에 기계적 감도 열 감도 하 그 리브스 테스트를 사용 하 여 평가 하는 동안에 폰 Frey 테스트를 사용 하 여 평가 됩니다. 중요 한 것은, 비 갖는 통/용어인 동적 체중 베어링 테스트를 사용 하 여 측정 됩니다. 이 이러한은 고통 측정값으로 널리 받아들여진다 고 통증 임계값 및 잠재적인 통증 동물15,,1617경험된에 중요 한 정보를 얻을. 다른 비 살려 통증 (예를 들면, 독립적인 자극), 바른된 장소 설정 테스트 등을 평가 하기 위해 측정, 귀중 한18을 수 있습니다. 하기 위해 통증을 억제 하는 약물의 잠재력을 평가, 수행 했습니다 융해 단백질의 intrathecal 관리 관리의이 경로와 적은 단백질 복용량 통증 관련 영역에 도달 하 여 피하 조직 (사이드-) 효과19, 필요 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 생산과 재조합 IL4-10 융해 단백질의 특성에 대 한 방법 및 지속적인 염증 성 통증의 마우스 모델에서 염증 성 통 억제에 효능을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 생산과 IL4-10 융해 단백질의 정화는 작은 규모에서 수행 됩니다. 그들은 통해 간결한 식 시스템에서 얻을 수 없는 포스트 번역 상 수정 때문 HEK293 세포 단백질 생산을 위한 식 시스템으로 선택 됩니다. 포스트 번역 상 수정 단백?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품의 일부는 위트레흐트 대학 생명 과학에 의해 자금 하고있다 부여
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
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