Kronik ağrı tedavisinde rekombinant proteinler gelişimi
Summary
Bu yazıda biz üretim yöntemleri ve bir IL4-10 rekombinant füzyon protein kalite kontrolü için ayrıntıları sağlar. Biz de bir fare modeli enflamatuar ağrı ağrı gidermek için bu proteinin etkinliğini test etmek nasıl göstereceğim.
Abstract
Kronik ağrı tedavi etmek zordur ve inatçı ağrı gidermek için yeni yaklaşımlar acilen ihtiyaç vardır. Anti-inflamatuar sitokinlerin zayıflatıcı acı koşulları nedeniyle kapasitelerini anormal nöro-bağışıklık etkileşimleri düzenleyen tedavisinde umut verici adaylar bulunmaktadır. Ancak, fizyolojik bir ağda çeşitli sitokinlerin çalışır ve bu nedenle onların tedavi edici etkiye tek başına ilaç olarak kullanıldığında en uygun olmayabilir. Bu sınırlamayı aşmak için IL4 ve IL10 anti-inflamatuar sitokinlerin bir füzyon protein geliştirdi. Burada, üretim ve kalite kontrol IL4-10 rekombinant füzyon proteinin yönelik yöntemler tanımlamak ve bir fare modeli inatçı enflamatuar ağrı ağrı gidermek için IL4-10 füzyon protein etkinliğini test.
Introduction
Kronik ağrı en 21, zayıflatıcı ve altında tedavi tıbbi problemlerden biri kalır etkileyen > yetişkin nüfusun1,%220’si. Ancak, kronik ağrı yardım sağlamak için Tedaviler çoğu kez etkisiz veya ciddi yan etkileri3nedeniyle devam etmemek gerekir. Önemli, şu anda kullanılabilir ilaçlar sadece semptomatik rahatlama sağlamak ama değil önemli ölçüde değiştirmek ya da kronik ağrı tedavi. Kronik ağrı bir nörolojik bozukluk gibi görünmesine karşın, kronik ağrı geliştirme4,5bağışıklık sisteminde katılımı kanıtlar gösteriyor. Ayrıca, ağrı tedavisinde bağışıklık tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkıyor. Örneğin, anti-inflamatuar sitokinlerin ağrı kronik ağrı6,7,8çeşitli modeller inhibe. Ancak, anti-inflamatuar sitokinlerin potansiyel ağrı inhibe etkileri azaltmak kısa bir yarı ömrü vardır. Ayrıca, anti-inflamatuar sitokinlerin en en iyi şekilde birbirleriyle uyum içinde çalışmak. Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için biz son zamanlarda anti-inflamatuar sitokinlerin İnterlökin-4 (IL4) ve İnterlökin-10 (IL10) bir molekül erimiş. IL4-10 füzyon protein bireysel sitokinler9‘ a göre kronik inflamatuar ve nöropatik ağrı inhibe üstün etkinlik gösterir. Burada biz böyle füzyon protein nasıl üretilir, saf, tarif ve nasıl kalite kontrol edilir.
IL4-10 füzyon proteini insan hücrelerinde pUPE ifade vektör IL4-10 füzyon protein kodlama cDNA sıra taşıyan bir HEK293-F hücreleri geçici transfection tarafından üretilir. HEK293-F hücreleri translasyonel modifikasyon protein, bakteriyel ifade sistemlerinde oluşmaz bir şey için izin vermek için seçilir. Glycan kapatma ile sialik asit, beta-galactoside-2, kodlama cDNA optimize etmek için 3-sialyl-transferaz ikinci bir transgene vektörde kurulmuştur. Füzyon proteini daha arıtma daha güçlü olduğu için benzeşme protein saflaştırma süpernatant kültürünün kullanarak diğer yöntemleri örneğin boyut-dışlama veya iyon Kromatografi10,11tarafından saf. IL4-10 füzyon protein arındırmak için şirket içinde yapılan monoklonal antikorlar IL4 karşı kullanılır. Saflık değerlendirilmesi ve bioactivity saf IL4-10 füzyon proteinin kalite kontrol bir parçası olarak gerçekleştirilir. Üretilen toplu işlemleri saflığı Sodyum Lauryl Sülfat Polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ve yüksek basınç boyutu dışlama Kromatografi (HP-sn) tarafından değerlendirilir. Bioactivity IL4-10 füzyon proteinin lipopolysaccharide (LPS) inhibe kapasitesini ölçülerek değerlendirilir-tümör nekrozis faktör-alfa (TNFα) üretim tam kan kültürlerinde indüklenen ve bireysel birleşime karşılaştırarak sitokinler.
Son olarak, IL4-10 füzyon protein kapasitesi kronik ağrı etkisizleştirmek için test etmek için biz nasıl füzyon protein inatçı enflamatuar ağrı12,13,14 yaygın olarak kullanılan fare modellerinde analjezik olarak test edilebilir tarif . Burada bir enflamatuar ağrı modeli yöntemleri açıklanmaktadır. Ancak, diğer ağrı modellerinde kullanılan (örneğin, nöropatik ağrı modelleri) olabilir, bağlı olarak araştırma cevap gerek bu sorular unutmamak önemlidir. Bu modeller ağrı değerlendirmek için uyarılmış dahil davranış ölçümleri ve sigara uyarılmış ağrı önlemleri çeşitli kullanmak önemlidir. Burada, değerlendirme yöntemleri mekanik ve termal olarak uyarılmış davranışsal yanıt değişimler için açıklanan. Zararsız uyaranlara karşı mekanik hassasiyeti termal duyarlılık Hargreaves testi kullanılarak değerlendirilir ederken Von Frey testi kullanarak değerlendirilir. Önemlisi, uyarılmış hyperalgesia/allodynia dinamik ağırlık taşıma testi kullanılarak ölçülür. Bu önlemlerin yaygın ağrı ölçü olarak kabul edilir ve ağrı eşikleri ve potansiyel ağrı hayvanlar15,16,17tarafından deneyimli hakkında önemli bilgiler sağlar. Diğer sigara uyarılmış ağrı (örneğin, uyarıcı bağımsız), klimalı yer tercih testi gibi değerlendirmek için önlemler, değerli18olabilir. Yönetim bu yolu ile daha az protein doz sistemik (side-) etkileri19önlemek ve ağrı ile ilgili alanlara ulaşmak için gerektiği gibi ağrı inhibe ilaç potansiyelini değerlendirmek için biz İntratekal yönetim füzyon proteinin gerçekleştirilen, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması yöntemleri için üretim ve rekombinant IL4-10 füzyon protein karakterizasyonu ve kalıcı enflamatuar ağrı fare modellerinde inflamatuar hyperalgesia inhibe onun etkinliğini test etmek için yöntemler açýklanmýþtýr. Üretim ve arıtma IL4-10 füzyon proteinin küçük bir ölçekte yapılır. Prokaryotik ifade sistemlerinde elde edilemez translasyonel modifikasyonlar etkinleştirmek çünkü protein üretim için bir ifade sistemi olarak HEK293 hücreler seçilir. Translasyonel modifikasyonlar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser parçası Utrecht Üniversitesi Yaşam Bilimleri tarafından finanse edilen hibe
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. . Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund’s Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
