Utviklingen av rekombinante proteinene til å behandle kroniske smerter
Summary
I denne artikkelen gir vi detaljer for metoder for produksjon og kvalitetskontroll av en IL4-10 rekombinant fusion protein. Vi viser også hvordan du teste effektiviteten av dette proteinet løse smerter i en musemodell av inflammatorisk smerte.
Abstract
Kronisk smerte er vanskelig å behandle og nye tilnærminger til løse vedvarende smerte er presserende nødvendig. Anti-inflammatorisk cytokiner er lovende kandidater for behandling av ødeleggende smertetilstander på grunn av deres evne til å regulere avvikende Nevro-immune interaksjoner. Men de arbeider fysiologisk i et nettverk av ulike cytokiner, og derfor deres terapeutiske effekten kan ikke være optimal som frittstående narkotika. For å overkomme denne begrensningen, utviklet vi et fusion protein av den anti-inflammatoriske cytokiner IL4 og IL10. Her beskriver vi metodene for produksjon og kvalitetssikring av IL4-10 rekombinant fusion protein og vi teste effektiviteten av IL4-10 fusion protein løse smerter i en musemodell av vedvarende inflammatorisk smerte.
Introduction
Kronisk smerte er fortsatt en av de mest ødeleggende og under-behandlet medisinske problemer av det 21st århundre, påvirker > 20% av den voksne befolkning1,2. Men behandlinger for å gi lindring fra kronisk smerte er ofte ineffektive eller må avsluttes på grunn av alvorlige bivirkninger3. Viktigere, for tiden tilgjengelig narkotika bare gi symptomatisk lindring, men ikke vesentlig endre eller kurere kronisk smerte. Selv om kroniske smerter synes å være en nevrologisk lidelse, tyder involvering av immunsystemet i kroniske smerter utvikling4,5. Videre er immun-baserte tilnærminger til å behandle smerter voksende. For eksempel hemme anti-inflammatoriske cytokiner smerte i flere modeller av kroniske smerter6,7,8. Men har anti-inflammatoriske cytokiner kort halveringstid, redusere deres potensielle smerte-hemmende effekter. Dessuten, anti-inflammatorisk cytokiner fungerer mest optimalt sammen med hverandre. For å overvinne disse begrensningene, smeltet vi nylig den anti-inflammatoriske cytokiner interleukin-4 (IL4) og interleukin-10 (IL10) i ett molekyl. IL4-10 fusion protein viser overlegen effekt i hemme kronisk inflammatorisk og nevropatisk smerte sammenlignet med personlige cytokiner9. Beskriver her vi hvordan slike fusion protein som produseres, renset, og hvordan kvaliteten er kontrollert.
IL4-10 fusion protein er produsert i menneskelige celler av forbigående transfection HEK293-F celler med en pUPE uttrykk vektor bærer cDNA sekvensen koding IL4-10 fusion protein. HEK293-F celler er valgt for post-translasjonell modifikasjon av protein, noe som ikke forekommer i bakteriell uttrykk systemer. Hvis du vil optimalisere glycan capping med sialic acid, cDNA koding beta-galactoside-2, er 3-sialyl-transferase innarbeidet i vektoren som en andre transgene. Fusion protein er renset bruker affinitet protein rensing av kulturen supernatant fordi det er kraftigere enn rensing av andre metoder f.eks størrelse-utestenging eller ionebytte kromatografi10,11. For å rense IL4-10 fusion protein, brukte vi huset gjort monoklonale antistoffer mot IL4. Evaluering av renhet og bioactivity renset IL4-10 fusion protein utføres som en del av kvalitetskontroll. Renheten av produsert grupper er evaluert av natrium Dodecyl Sulfate polyakrylamid Gel gelelektroforese (SDS-side) og høyt trykk størrelse utelukkelse kromatografi (HP-SEC). Bioactivity av IL4-10 fusion protein beregnes ved å måle kapasiteten å hemme lipopolysakkarid (LPS)-indusert tumor nekrose faktor-alpha (TNFα) produksjon i fullblod kulturer, og sammenligne den kombinasjonen av enkelt cytokiner.
Til slutt, for å teste kapasiteten til IL4-10 fusion proteiner å hemme kronisk smerte, beskriver vi hvordan fusion protein kan bli testet som smertestillende i brukte musen modeller av vedvarende inflammatorisk smerte12,13,14 . Her beskriver vi metoder for en inflammatorisk smerte modell. Det er imidlertid viktig å merke seg at andre smerte modeller kan brukes (f.eksnevropatisk smerte modeller), avhengig av forskningen spørsmål som må besvares. For å vurdere smerter i disse modellene, er det viktig å bruke en rekke atferdsmessige tiltak som inkluderer fremkalt og ikke-utløste smerter tiltak. Her beskrevet vi metoder for vurdering for endringer i mekanisk og termisk vakte atferdsdata svar. Mekanisk følsomhet til ufarlige stimuli vurderes ved hjelp av Von Frey testen, mens termiske følsomhet vurderes ved hjelp av Hargreaves testen. Viktigere, måles ikke-utløste hyperalgesia/allodynia ved hjelp av dynamiske vekt bærende testen. Disse tiltakene er allment akseptert som smerte mål og gi viktig informasjon om smerte terskler og potensielle smerter oppleves av dyr15,16,17. Andre tiltak for å vurdere ikke utløste smerter (f.eks, stimulans uavhengig), for eksempel betinget sted preferanse testen, kan være verdifulle18. For å vurdere potensialet av stoffet å hemme smerte, utført vi intratekal administrasjon av fusion protein, som med denne bruksmåten mindre protein dose er nødvendig for å nå smerte-relaterte områder og unngå systemisk (side-) effekter19, 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskriptet beskriver metoder for produksjon og karakterisering av en rekombinant IL4-10 fusion protein og metoder for å teste effektiviteten i hemme inflammatorisk hyperalgesia i musen modeller av vedvarende inflammatorisk smerte. Produksjon og rensing av IL4-10 fusion protein utføres på en liten skala. HEK293 celler er merket som et uttrykk for protein produksjon fordi de aktivere post-translasjonell endringer som kan oppnås i prokaryote uttrykk systemer. Post-translasjonell modifikasjoner er relevante for p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Del av dette arbeidet har vært finansiert av en Utrecht University biovitenskap gi
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. . Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund’s Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
