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Immunology and Infection

माइक्रोबियल संक्रमण और विश्लेषण के लिए Drosophila melanogaster लार्वा से Hemocytes का निष्कर्षण

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57077
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

Summary

इस विधि को दर्शाता है कि कैसे तीन आयामी (3 डी) मॉडल के साथ कीट कोशिकाओं में रोगज़नक़ आक्रमण कल्पना करने के लिए । Drosophila लार्वा से Hemocytes वायरल या जीवाणु रोगजनकों, या तो पूर्व vivo या vivo मेंसंक्रमित थे । संक्रमित hemocytes तो तय कर रहे थे और एक फोकल माइक्रोस्कोप और बाद में 3 डी सेलुलर पुनर्निर्माण के साथ इमेजिंग के लिए दाग ।

Abstract

Drosophila melanogaster के रोगजनक संक्रमण के दौरान, hemocytes संक्रमण भर में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक विधि विकसित करने के लिए मक्खियों के एक विशिष्ट प्रतिरक्षा डिब्बे में रोगज़नक़ आक्रमण कल्पना, अर्थात् hemocytes है । यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग कर, 3 × 106 जीवित hemocytes २०० Drosophila 3rd instar लार्वा से 30 मिनट में पूर्व vivo संक्रमण के लिए प्राप्त किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, hemocytes 3rd instar लार्वा के इंजेक्शन के माध्यम से vivo में संक्रमित किया जा सकता है hemocyte निष्कर्षण के बाद 24 एच के बाद संक्रमण. ये संक्रमित प्राथमिक कोशिकाओं, तय दाग थे, और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि । फिर, 3 डी निरूपण निश्चित रोगज़नक़ आक्रमण दिखाने के लिए छवियों से उत्पन्न किया गया । इसके अतिरिक्त, qRT-पीसीआर के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए संक्रमण के बाद रोगज़नक़ mRNA का पता लगाने के लिए प्राप्त किया जा सकता है, और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं से पर्याप्त प्रोटीन निकाला जा सकता है । एक साथ लिया, हम रोगज़नक़ आक्रमण और जीवाणु और वायरल रोगज़नक़ प्रकार और hemocyte निष्कर्षण के लिए एक कुशल विधि का उपयोग कर संक्रमण की पुष्टि के निश्चित सुलह के लिए एक विधि मौजूद करने के लिए पर्याप्त Drosophila से लाइव hemocytes प्राप्त करने के लिए पूर्व vivo और vivo संक्रमण प्रयोगों में के लिए लार्वा ।

Introduction

Drosophila melanogaster जन्मजात उन्मुक्ति1के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, hemocytes रोगज़नक़ चुनौती के जवाब में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । Hemocytes परजीवी encapsulating के लिए महत्वपूर्ण हैं, साथ ही कवक के दौरान phagocytic कार्रवाई के माध्यम से रोगज़नक़ का मुकाबला करने में एक महत्वपूर्ण समारोह होने, वायरल, और बैक्टीरियल संक्रमण2,3.

आदेश में सबसे अच्छा रोगजनक माइक्रोबियल संक्रमण के लिए मेजबान के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए, यह कल्पना कैसे रोगज़नक़ संक्रमण के दौरान मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह दृश्य आक्रमण के तंत्र की समझ में योगदान देता है । एक साथ रोगज़नक़ intracellular स्थानीयकरण और सेलुलर प्रतिक्रिया के विवरण के साथ, इन आंकड़ों के साथ संक्रमण और सेलुलर organelles जिसके साथ सूक्ष्म जीव इंटरैक्ट करता है के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, 3 डी मॉडल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के बाद पुनर्निर्माण के लिए मेजबान कोशिकाओं में रोगजनकों के सटीक स्थान का निर्धारण मददगार हो सकता है । इस अध्ययन में, हम Coxiella burnetii के आक्रमण की कल्पना (सी. burnetii), क्यू बुखार के प्रेरणा का एजेंट, एक पशुजन्य रोग है कि दोनों मानव और पशु स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है, प्राथमिक Drosophila hemocytes में । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गयाहै कि Drosophila के लिए अतिसंवेदनशील है २ ९ माइल द्वितीय चरण (NMII) C. burnetii के क्लोन 4 तनाव और है कि इस तनाव को Drosophila 4 में दोहराने में सक्षम है, यह दर्शाता है कि Drosophila एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सी. burnetii रोगजनन अध्ययन ।

पिछले अध्ययनों hemocytes का इस्तेमाल किया है मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच । Hemocytes का उपयोग रूपात्मक टिप्पणियों के लिए किया गया है5,6,7, morphometric विश्लेषण2,8, phagocytosis विश्लेषण2,3, qRT-पीसीआर2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent एनालिसिस10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 और immunohistochemistry9,14. हालांकि Drosophila S2 कोशिकाओं को भी विभिंन इन विट्रो प्रयोगों, immortalization और संभावित पहले से मौजूद वायरल संक्रमण उनके व्यवहार में परिवर्तन15,16के लिए उपलब्ध हैं । इस तरह के S2 कोशिकाओं के रूप में एक अमर सेल लाइन, के खिलाफ प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग, एक प्रणाली में जंमजात प्रतिरक्षा समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और पूरे जीव के प्रतिनिधि । इसके अतिरिक्त, vivo मेंhemocytes के संक्रमण, निष्कर्षण से पहले, कोशिकाओं अंय मेजबान प्रोटीन और ऊतक, hemocytes के निष्कर्षण पर एक लाभ से पहले पूर्व vivo संक्रमण के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है । विभिंन तरीकों की एक संख्या के लिए समय की एक छोटी अवधि में hemocytes की एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया है hemocytes जिंदा रखने के लिए8,17,18,19।

इस अध्ययन में, हम सी. burnetii, लिस्टिरिया monocytogenes (लिस्टिरिया), या Invertebrate इंद्रधनुषी के साथ रोगजनक माइक्रोबियल संक्रमण के लिए Drosophila 3आरडी instar लार्वा से hemocytes निकालने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं वायरस 6 (IIV6) । हम दोनों के लिए तरीकों का वर्णन vivo और पूर्व vivo hemocyte संक्रमण में । vivo में-और पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ visualized थे और C. burnetii आक्रमण के 3 डी मॉडल का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अतिरिक्त, निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति परख के लिए इस्तेमाल किया गया । विशेष रूप से, IIV6 और लिस्टिरियाके साथ संक्रमण की सीमा की जांच करने के लिए, कुल आरएनए या प्रोटीन qRT-पीसीआर या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं से अलग किया गया था । एक साथ लिया, प्रोटोकॉल तेजी से 3rd instar लार्वा और सबूत है कि प्राथमिक hemocytes से hemocytes की उच्च संख्या इकट्ठा करने के लिए तरीके प्रदान करता है, vivo में या तो संक्रमित या पूर्व vivo, माइक्रोबियल के लिए एक उपयुक्त मंच हैं रोगज़नक़ संक्रमण अध्ययन और ऐसे माइक्रोस्कोपी, transcriptomics, और प्रोटियोमिक् के रूप में लागू बहाव के विश्लेषण ।

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Protocol

1. पूर्व vivo संक्रमण

  1. मध्यम और उपकरण
    1. बाँझ शर्तों के तहत, ताजा Drosophila Hemocyte अलग मध्यम (धिम) 25% भ्रूण गोजातीय सीरम (Drosophila) और फिल्टर के साथ ७५% Schneider के FBS माध्यम से युक्त तैयार करें ।
    2. परत एक stereomicroscope के तहत 10 सेमी x 10 सेमी आयल फिल्म के 2-3 टुकड़े ।
    3. कांच केशिका तैयार करें । अधिकतम के ५५% करने के लिए केशिका खींचने हीटर सेट करें । लगभग 10 µm के एक तेज बिंदु के लिए केशिका ट्यूब खींचो ।
    4. Backfill को खनिज तेल से केशिकाएं ।
    5. nanoinjector पर भर केशिका ट्यूब इकट्ठा (चित्रा 1ए), और संदंश (चित्रा 1बी) के साथ बंद टिप तोड़कर खुले जुड़े केशिका ट्यूब टिप । टिप के बाहरी व्यास hemocytes के आसान के लिए µm १०० होना चाहिए ।
    6. केशिका ट्यूब टिप से जितना संभव हो उतना तेल बाहर निकालें, फिर धिम से भरें । ऊपर ले hemolymph और तेल की सीमा के आसान दृश्य के लिए, तेल और धिम के बीच एक हवा बुलबुला (चित्रा 1बी') शामिल हैं ।
  2. Hemolymph निष्कर्षण
    1. भोजन की शीशियों के अंदर की दीवार से 3rd instar Drosophila लार्वा उठाओ धीरे संदंश का उपयोग कर और उन्हें एक १०० µm छलनी में जगह (चित्रा 1सी). 3rd instar लार्वा एक वयस्क महिला द्वारा उपजाऊ अंडा बिछाने के बाद 3-6 दिन पाए जाते हैं ।
      नोट: इन प्रयोगों जीनोटाइप, डब्ल्यू१११८का उपयोग किया; p {w+ mC= Hml-GAL4. Δ} 2, p {w+ mC= यूएएस-2xEGFP} AH2, के बाद से hemocytes इन जानवरों से बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) सूक्ष्म द्वारा कोशिकाओं की पहचान में सहायता करने के लिए एक्सप्रेस ।
    2. लार्वा पर बाँझ पानी की 5 मिलीलीटर डालो और 5 एस के लिए छलनी शेक । अतिरिक्त पानी (चित्रा 1सी') को दूर करने के लिए टास्क वाइप पर छलनी रखें ।
    3. लार्वा को १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ट्रांसफर कर दीजिये । 5 एस (चित्रा 1डी) के लिए सह2 गैस के साथ उन्हें Anesthetize.
    4. stereomicroscope के अंतर्गत आयल फिल्म पर लार्वा प्लेस, पृष्ठीय पक्ष के साथ ऊपर का सामना करना पड़ (चित्रा 2ए) ।
    5. कांच केशिका लार्वा पीछे शरीर पर हल्के से प्लेस में इसे पकड़ और पीछे छल्ली खुला ठीक कहा संदंश का उपयोग कर (चित्रा 2बी) को बाधित ।
    6. hemolymph को आयल फिल्म (चित्रा २सी) पर प्रवाहित करने की अनुमति दें ।
    7. आयल फिल्म पर एक बार में 20-50 लार्वा से hemocytes सहित hemolymph का पूल बनाओ ।
    8. nanoinjector (चित्रा 2डी) पर ग्लास केशिका का उपयोग कर परित hemolymph ले लो ।
      नोट: hemolymph के लगभग 10-20 µ l होना चाहिए ।
    9. hemolymph को १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निकालकर ५०० µ l को धिम (चित्रा 2ई) से युक्त कर दीजिये ।
    10. दोहराएं कदम 1.2.4)-1.2.9) लार्वा के हर बैच के लिए ।
  3. hemocytes की संख्या गिनना ।
    1. पिपेट एक ०.६ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ०.४% Trypan नीले समाधान के 5 µ एल मृत कोशिकाओं दाग करने के लिए । धीरे से एक पिपेट का उपयोग कर १.५ मिलीलीटर ट्यूब में धिम और hemocytes मिश्रण है, और ०.६ मिलीलीटर धिम ट्यूब और धीरे मिश्रण करने के लिए hemocytes सहित microcentrifuge के 5 µ एल हस्तांतरण ।
    2. पिपेट 1:1 Trypan नीले से कोशिकाओं के 10 µ एल: hemocytometer में hemocyte मिश्रण ।
    3. hemocytomter के 4 कोने क्षेत्रों में से प्रत्येक में Trypan नीले रंग के साथ दाग नहीं कर रहे हैं और सूत्र का उपयोग milliliter प्रति hemocytes की एकाग्रता की गणना कि लाइव hemocytes की संख्या गणना:
      Equation 1
      जहां X milliliter प्रति लाइव hemocytes की एकाग्रता है; a, b, c, और d (जैसा कि Trypan नीला बहिष्करण द्वारा निर्धारित) hemocytometer में गिना गया फ़ील्ड के प्रत्येक 4 में जीवित कोशिकाओं की संख्या हैं । गणना कक्षों की कुल संख्या के 2 से विभाजन Trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं के 1:1 कमजोर पड़ने के कारण है । कोशिकाओं Trypan नीले रंग के साथ दाग मृत माना जाता है ।
  4. पूर्व वीवो संक्रमण
    1. कुओं की संख्या निर्धारित timepoints और जैविक प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक प्रतिकृति के आधार पर कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जाना है । 5.0 × 104 hemocytes संक्रमण के बाद आरएनए और प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए वांछनीय हैं ।
    2. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर संक्रमण के लिए धिम के साथ पतला होने के लिए रोगज़नक़ स्टॉक की मात्रा की गणना:
      Equation 2
      जहां संक्रमण की बहुलता (MOI) सेल प्रति वांछित वायरल या बैक्टीरिया की संख्या है ।
      नोट: MOI इस्तेमाल किया व्यक्तिगत प्रयोग और परख प्रदर्शन पर निर्भर करता है । यहां, 10 जीनोम समकक्ष (जीई)/cell के सी. burnetii, 10 CFU/ लिस्टिरियाके सेल, या 1 TCID५०/cell का IIV6 इस्तेमाल किया गया ।
    3. एक ट्यूब में वायरल या बैक्टीरियल मात्रा के लिए धिम की उचित मात्रा को जोड़कर एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं के लिए रोगज़नक़ माध्यम के ५०० µ एल तैयार करें ।
    4. एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से एक 12 मिमी दौर कवर ग्लास (नंबर 1 मोटाई) प्लेस ।
    5. धिम को 24-वेल प्लेट के कुंए में hemocytes सहित विभक्त करें ।
    6. एक अच्छी तरह से hemocytes में रोगज़नक़ माध्यम के ५०० µ एल जोड़ें ।
    7. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
    8. 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए थाली मशीन । हर 15 मिनट, धीरे से सामने करने के लिए वापस से थाली झुकाव है, तो हाथ से 5 एस के लिए सही करने के लिए छोड़ दिया ।
    9. आक्रमण/अनुलग्नक चरण 1.4.8 के 1 ज के बाद), धीरे रोगज़नक़ मध्यम पिपेट और ताजा धिम के साथ hemocytes धोने, और यह ताजा µ के ५०० धिम एल के साथ फिर से भरना ।
    10. वांछित समय के लिए संक्रमित hemocytes की मशीन । इन प्रयोगों में, C. burnetii-या IIV6-संक्रमित hemocytes 24 ज के लिए मशीन हैं, और लिस्टिरिया-संक्रमित hemocytes 1, 2, या 4 एच के लिए मशीन हैं ।

2. vivo में इंफेक्शन

  1. संक्रमण
    1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Drosophila फलों का रस आगर प्लेट गर्म के रूप में पहले20वर्णित प्लेटें किया जाता है ।
      1. ७०० मिलीलीटर पानी के लिए आगर के 30 ग्राम जोड़ें और इसे ४० मिनट के लिए आटोक्लेव ।
      2. निरपेक्ष इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में मिथाइल paraben के ०.५ g भंग ।
      3. मिथाइल paraben समाधान जोड़ें फलों का रस ध्यान की ३०० मिलीलीटर ।
      4. जल्दी रस autoclaved आगर समाधान में ध्यान केंद्रित मिश्रण और 10 × ३५ mm पेट्री व्यंजन में 5 मिलीलीटर बांटना ।
      5. के बाद प्लेटें 15 मिनट के लिए ठंडा है, उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. 3rd instar लार्वा निंन चरण 1.2.1)-1.2.3) तैयार करें ।
    3. एक आगर प्लेट पर खमीर पेस्ट रखें । जहां लार्वा (चित्रा 3) सुखाने से बचने के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं आगर प्लेट में ठीक कटौती करें । एक ०.००१ मिमी इकट्ठा तेल फिल्म (चित्रा 3बी, सी) का उपयोग संदंश धारण के साथ टंगस्टन सुई बताया ।
    4. पिपेट ५० µ एल के उच्च-titer mCherry व्यक्त-C. burnetii (5.95 × 109 जीई/एमएल) स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत आयल फिल्म पर और जीवाणुओं के पूल में लार्वा जगह है ।
    5. लार्वा को बैक्टीरिया के पूल में रखें । एक टंगस्टन सुई (चित्रा 3डी) के साथ लार्वा चुभन । एक आगर प्लेट (चित्रा 3ई) पर लार्वा स्थानांतरण ।
    6. शेष रोगज़नक़ मध्यम पर आगर प्लेट हस्तांतरण और तेल फिल्म के साथ प्लेट सील ।
    7. लार्वा को नम हवा में थाली पर रखें जब तक वांछित समय पश्चात संक्रमण (चित्रा 3F) । इस प्रयोग में, C. burnetii-संक्रमित लार्वा 24 ज के लिए प्लेट पर हैं ।
  2. Hemolymph निष्कर्षण और hemocytes के चढ़ाना
    1. मध्यम और उपकरण निंन चरण १.१) तैयार करें ।
    2. एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से एक 12 मिमी दौर कवर ग्लास (नंबर 1 मोटाई) प्लेस । पिपेट ५०० में धिम के µ l को अच्छी तरह से.
    3. संक्रमित लार्वा से hemolymph को निम्न चरणों में निकालें 1.2.4)-1.2.8).
    4. hemolymph को वेल म् स्टेप -8 ए में बाहर निकालें).
    5. दोहराएँ 2.2.3) और 2.2.4) लार्वा के कई बैचों के लिए.
    6. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर थाली केंद्रापसारक ।

3. दृश्य

  1. फिक्सिंग और धुंधला
    1. hemocytes अच्छी तरह से गोल कवर ग्लास पर बसने के लिए अनुमति देने के बाद, धीरे से एक अच्छी तरह से मध्यम निकालें ।
    2. धीरे से जोड़ें २०० µ के एल 4% paraformaldehyde (पीएफए) के प्रत्येक अच्छी तरह से बसे hemocytes । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए hemocytes की मशीन ।
    3. 4% पीएफए निकालें और धीरे से एक अच्छी तरह से ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० और 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) युक्त पंजाब के २०० µ एल जोड़ें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए hemocytes की मशीन ।
    4. पंजाबियों को हटाने और धीरे से 1 × 4 ' के २०० µ एल जोड़ने के लिए, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए । कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए hemocytes की मशीन ।
    5. DAPI समाधान निकालें और धीरे से एक अच्छी तरह से पंजाबियों जोड़ें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए hemocytes की मशीन ।
    6. एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर antifade बढ़ते माध्यम के 10 µ एल ड्रॉप ।
    7. प्रत्येक कुआं से पंजाबियों को हटाने के बाद, ठीक नुकीले संदंश का उपयोग करके 24-अच्छी प्लेट से कवर ग्लास निकालें । धीरे कांच स्लाइड पर antifade बढ़ते मध्यम पर कवर कांच जगह है, नीचे का सामना करना पड़ hemocytes के साथ ।
    8. स्लाइड को रात भर अंधेरे में रखकर सूखने दें ।
  2. फोकल इमेजिंग
    1. DAPI, EGFP, और mCherry के तीन रंग इमेजिंग के लिए फोकल माइक्रोस्कोप कॉंफ़िगर करें । निंन सेटिंग का उपयोग करें: DAPI उत्तेजना (पूर्व) ४०५ एनएम, उत्सर्जन (em) 415-480 एनएम; EGFP ex ४८८ एनएम, em 493-564 एनएम; mCherry पूर्व ५८७ एनएम, em 597-700 एनएम ।
    2. एक 63X/1.4 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य का उपयोग कर नमूने पर माइक्रोस्कोप और ध्यान केंद्रित पर नमूना रखें । इमेजिंग के लिए दृश्य के क्षेत्र में वांछित hemocytes का पता लगाएँ.
    3. नमूना के उचित जोखिम को प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ को समायोजित करें । जोखिम स्तर पूरे नमूना मोटाई के लिए उपयुक्त है यह सुनिश्चित करने के लिए एकाधिक z-विमानों की जाँच करें ।
    4. एक पूरी hemocyte के z-अक्ष पर ऊपर और नीचे की स्थिति का पता लगाएं । z-अनुभाग के लिए प्रारंभ और अंत पदों के रूप में इन पदों पर सेट करें ।
    5. केवल hemocyte युक्त क्षेत्र छवि के लिए स्कैनिंग ज़ूम का उपयोग करें । 3x के ज़ूम कारकों अक्सर प्रयोग किया जाता है ।
    6. x-y विमान में १०२४ x १०२४ पिक्सेल जैसे उचित रिज़ॉल्यूशन पर छवि श्रृंखला ले लीजिए, और z आयाम में ०.३ µm रिक्ति है ।
  3. 3d मॉडल पुनर्निर्माण
    नोट: ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर मौजूद है कि 3 डी मॉडल पुनर्निर्माण के लिए नीचे वर्णित कार्यों के कई प्रदर्शन करता है ।
    1. 3 डी मॉडल पुनर्निर्माण के लिए फोकल माइक्रोस्कोप के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर में z-खोदी गई छवि श्रृंखला फ़ाइल आयात करें ।
    2. एक EGFP व्यक्त hemocyte में DAPI और mCherry व्यक्त सी. burnetii के साथ दाग नाभिक के सह स्थानीयकरण दिखा एक सेल का चयन करें । केवल एकल कक्ष को शामिल करने के लिए छवि श्रृंखला क्रॉप करें ।
    3. 3 डी दर्शक विकल्प है जो सॉफ्टवेयर के पूर्व पैक एल्गोरिथ्म का उपयोग कर 3 डी मॉडल को खंगाला का चयन करें । मिश्रण, सतह, और मिश्रित विकल्पों के बीच 3 डी प्रतिनिधित्व के वांछित प्रकार चुनें । इस विधि में, hemocytes, नाभिक, और C. burnetii सरफ़ेस मॉडल का उपयोग कर दिखाए जाते हैं ।
    4. माउस बटन पकड़ और स्क्रीन के चारों ओर कर्सर खींचने के द्वारा विभिन्न देखने के पदों से 3 डी खंगाला सेल का निरीक्षण करें । छवि ऑप्टिमाइज़ करने के लिए मॉडल्ड लाइट स्रोत की कक्ष ओरिएंटेशन और स्थिति समायोजित करें । अस्पष्टता के लिए अंय विकल्प, ंयूनतम और अधिकतम सीमा, Specular, परिवेश, चमक, और गामा के लिए छवि का अनुकूलन मौजूद हैं ।
    5. hemocyte की आंतरिक सामग्री को विज़ुअलाइज़ करने के लिए क्लिपिंग और अनुभागिंग आदेशों का उपयोग करके मॉडल के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन लें.

4. जीन और/या प्रोटीन विश्लेषण के लिए आवेदन

  1. IIV6 और लिस्टिरिया, बाद में qRT-पीसीआर या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए लाइसे कोशिकाओं के साथ संक्रमण के बाद पहले21 और निंनलिखित निर्माता के निर्देशों का वर्णन के रूप में वर्णित है ।
    नोट: qRT-पीसीआर और पश्चिमी दाग के लिए एंटीबॉडी के लिए प्राइमरों के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  2. agarose जेल ट्रो द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण, के रूप में पहले से वर्णित22, प्रवर्धित उत्पाद की उचित लंबाई सुनिश्चित करने के लिए ।

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Representative Results

पूर्व vivo संक्रमण के लिए लाइव hemocytes इकट्ठा करने के लिए, अप करने के लिए 3 × 106 hemocytes २०० Drosophila 3rd instar लार्वा से निकाले गए थे । हमारी विधि विकसित करने के लिए, विभिंन तकनीकों का एक नंबर का प्रयास किया गया । व्यक्तिगत लार्वा विच्छेदन १.५ ज तक ले जाएगा, और ~ ८००० कोशिकाओं के एक औसत इस विधि का उपयोग कर प्राप्त किया गया था18, जिनमें से अधिकांश संग्रह के अंत तक जीवित नहीं थे । अगले, हम hemolymph, जो hemocytes निहित एक समय में 20 लार्वा से एक ग्लास केशिका ट्यूब19का उपयोग कर निकालने की कोशिश की, लेकिन केशिका छल्ली सामग्री के साथ भरा हो गया और hemolymph कुशलता से कांच द्वारा लिया जा करने में सक्षम नहीं था केशिका. अंत में, हम ठीक संदंश12के साथ बैच प्रति 20-50 लार्वा की छल्ली यांत्रिक, और आसान के लिए hemolymph के एक पूल बनाया । इसमें बड़ी संख्या में लार्वा (Table 1) से hemocytes की बड़ी मात्रा के आसान संग्रह की अनुमति दी गई है ।

करने के लिए संकेत मिलता है कि निकाले hemocytes जीवित और संक्रमण के लिए उपयुक्त थे, एक Trypan नीले अपवर्जन परख के लिए जीना hemocytes के प्रतिशत की गणना करने के लिए यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग कर निकाला (चित्रा 6किया गया था) । इसके अलावा, हम एक पहले से प्रकाशित विधि के साथ hemocyte निष्कर्षण के लिए हमारी विधि की तुलना में जहां लक्ष्य को अलग करने के लिए एक यांत्रिक व्यवधान विधि विकसित करने और व्यक्तिगत Drosophila से परिसंचारी और निवासी hemocytes के बीच अंतर करने के लिए किया गया था लार्वा23. 10 स्वतंत्र प्रयोगात्मक अलगाव से दो तरीकों के बीच तुलना पर, हमने देखा कि कोशिका व्यवहार्यता थोड़ा अधिक यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग कर रहा था (चित्रा 6ए); हालांकि, Petraki एट अलसे विधि । हर 10 विच्छेदित लार्वा (चित्रा 6बी) से कई hemocytes के रूप में दो बार के लिए करीब झुकेंगे । Petraki एट अलसे hemocytes की बढ़ी हुई संख्या के लिए एक कारण । विधि यह है कि इस विधि निवासी (sessile) hemocytes, साथ ही साथ घूम hemocytes इकट्ठा । पुष्टि करने के लिए कि यहां प्रस्तुत विधि के साथ निकाली गई कोशिकाओं वास्तव में hemocytes में थे, हम एक मक्खी transgenes hemolectin (Hml) प्रवर्तक GAL4 कि नदी के ऊपर उत्प्रेरक अनुक्रम (hemocytes) बांध में यूएएस ड्राइविंग के लिए युक्त लाइन का उपयोग hemocytes में बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) प्रतिलेखन और अभिव्यक्ति सक्रिय करें । Hemocytes से hml-GAL4 > यूएएस-EGFP लार्वा चैम्बर्ड coverglass स्लाइड, फिक्स्ड, permeabilized और DAPI के साथ दाग के रूप में पहले21वर्णित पर निकाले गए थे । चित्रा 7 से पता चलता है कि ज्यादातर DAPI-पॉजिटिव कोशिकाएं भी EGFP-पॉजिटिव होती हैं । ठहराव सह अभिव्यक्ति की कई छवियों, जहां से हम गणना की है कि 86 ± कोशिकाओं के 9% अलग hemocytes थे से प्रदर्शन किया गया ।

Drosophila hemocytes में रोगज़नक़ आक्रमण के अभिनव 3 डी मॉडल में प्रोटोकॉल पूर्व vivo या vivo C. burnetii संक्रमण में निंनलिखित 3rd instar लार्वा से निकाले गए । हम C. burnetii संक्रमण के बाद से बैक्टीरिया एक्सप्रेस mCherry छवि करने में सक्षम थे । संक्रमित hemocytes के बाद तय कर रहे थे और दाग, वे DAPI, EGFP, और mCherry के लिए imaged थे फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । Hemocyte संक्रमण दरों, के रूप में EGFP-सकारात्मक कोशिकाओं है कि भी mCherry संकेत प्रदर्शन के प्रतिशत के द्वारा निर्धारित, दोनों के लिए पूर्व vivo और vivo C. burnetii संक्रमण लगभग १००% था । इस के बाद से एक MOI 10 जीई/सेल के पूर्व vivo संक्रमण है, जो कोशिकाओं के १००%24के संक्रमण में परिणाम चाहिए के लिए इस्तेमाल किया गया था की उंमीद थी । vivo में संक्रमण के बारे में, के बाद से लार्वा mCherry एक्सप्रेस-सी. burnetii (5.95 × 109 जीई/एमएल) की एक उच्च-titer छोटी बूंद में रखा जाता है, जीवाणुओं की संख्या लगभग १०,०००-गुना अधिक लार्वा प्रति hemocytes की संख्या से अधिक है । इसलिए, एक १००% संक्रमण दर vivo में संक्रमण के लिए अपेक्षित है ।

अगले, जेड वर्गों hemocyte के माध्यम से एकत्र किए गए 3 डी में पूरे सेल कल्पना, और सेल के इंटीरियर में C. burnetii की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए । चित्रा 4 एक hemocyte के पारदर्शी पार वर्गों से पता चलता है (हरे रंग में) सी. burnetii (लाल में) के साथ सेल के इंटीरियर में देखा । छवियों को भी एक 3 डी मॉडल (चित्रा 5) hemocyte और सी. burnetiiकी सतहों का प्रतिनिधित्व करने में फिर से खंगाला गया, फिर से पार के इंटीरियर में सी. burnetii दिखा-खोदी hemocytes । दिलचस्प है, vivo मेंसंक्रमित hemocytes अधिक से अधिक cytoplasmic एक्सटेंशन प्रदर्शन किया और प्रकृति में चापलूसी कर रहे थे, जबकि पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes अधिक गोलाकार थे (चित्रा 5) । यह पूर्व vivo जनसंख्या7में vivo-संक्रमित जनसंख्या और plasmatocytes में lamellocytes की एक बड़ी आबादी का संकेत हो सकता है । जबकि lamellocyte भेदभाव आम तौर पर परजीवी ततैया संक्रमण के दौरान प्रेरित है25, Drosophila लार्वा के घायल भी lamellocyte विभेद26प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है । अंत में, जबकि यहां प्रस्तुत प्रयोगों में उपयोग नहीं किया है, वहां लिस्टिरिया27 और IIV628 कि hemocyte संक्रमण के 3 डी मॉडल उत्पंन किया जा सकता है की GFP-व्यक्त रूपों हैं । इसके बजाय, पश्चिमी सोख्ता और qRT-पीसीआर प्रयोगों के लिए लिस्टिरिया-और IIV6-संक्रमित hemocytes का इस्तेमाल किया गया ।

यहां प्रस्तुत विधि का प्रयोग, संक्रमण दोनों पूर्व vivo प्रदर्शन कर रहे है और इमेजिंग के लिए vivo में । इसके अलावा, रोगज़नक़ mRNA और प्रोटीन विश्लेषण पूर्व vivo संक्रमण के बाद । विशेष रूप से, निकाली hemocytes IIV6 से संक्रमित थे और qRT-पीसीआर विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया । यह IIV6 के काफी उच्च स्तर-193R, एक वायरल जीन है कि apoptosis29के एक ख्यात अवरोध करनेवाला के लिए सांकेतिक शब्दों में दिखाया, नकली और IIV6 संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 8ए) के बीच । प्रवर्धित उत्पादों के ट्रो संक्रमित नमूने में IIV6-193R जीन उत्पाद के लिए एक बैंड की उपस्थिति की पुष्टि की है, लेकिन नहीं नकली संक्रमित नमूना (चित्रा 8बी). RpII अंतर्जात नियंत्रण के लिए प्रवर्धित बैंड सभी नमूनों में पाए गए थे, और S2 कोशिकाओं में IIV6 संक्रमण एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रदर्शन किया गया । के बाद से IIV6 संक्रमण के एक MOI पर प्रदर्शन किया गया 1 TCID५०/cell, लगभग ५०% कोशिकाओं के संक्रमित होने की उंमीद थी, Poisson वितरण के आधार पर24।

नकली या लिस्टिरिया-संक्रमित hemocytes से कुल प्रोटीन 1, 2 और 4 एच पोस्ट पर एकत्र किया गया था-संक्रमण और प्रोटीन एकाग्रता Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा निर्धारित किया गया था । १००% कोशिकाओं के संक्रमित होने की उंमीद थी पूर्व vivo के बाद से MOI था 10 CFU/सेल24। पश्चिमी सोख्ता संक्रमित hemocytes में उच्च स्तर 4 एच के बाद संक्रमण (चित्रा 9) द्वारा प्राप्त के साथ लिस्टिरिया-व्युत्पंन प्रोटीन उत्पादों की उपस्थिति की पुष्टि करता है । लिस्टिरिया इनोक्युलम लिस्टिरिया-विशिष्ट बैंड का पता लगाने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । actin की उपस्थिति प्रोटीन लदान के स्तर की पुष्टि करने के लिए hemocyte नमूनों में दिखाया गया है । एक साथ लिया, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि hemocytes यहां प्रस्तुत की विधि का उपयोग कर निकाले दोनों वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण प्रयोगों के लिए उपयुक्त थे ।

Figure 1
चित्र 1 : उपकरण और hemocyte निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल सामग्री की रूपरेखा । उपकरण पहले विच्छेदन के लिए तैयार किया गया था । क) खींची हुई काँच केशिका को खनिज तेल से भरे पीठ के बाद nanoinjector में सम्मिलित किया गया. ख) कांच केशिका के जुड़े टिप संदंश के साथ टूट गया था एक १०० µm बाहरी व्यास बनाने के लिए । ख ') धिम केशिका द्वारा लिया गया था सेल संदूषण और हवा के बुलबुले से बचने के लिए तेल और धिम के बीच एक स्पष्ट अंतर बनाने के लिए शुरू किए गए थे । ग) लार्वा खाद्य शीशियों से उठाया जाता है और एक सेल छलनी में रखा जाता है । ग ') लार्वा बाँझ पानी में धोया जाता है और एक कार्य पोंछे के साथ पानी निकाल दिया जाता है, घ) लार्वा एक microcentrifuge ट्यूब और anesthetized में सह2 गैस के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : समयरेखा और hemocytes के निष्कर्षण के लिए प्रवाह चार्ट. A) लार्वा को छल्ली खोलने से पहले उनके पृष्ठीय पक्ष पर रखा जाता है । ख) छल्ली ठीक नुकीले संदंश और केशिका सुई के साथ बाधित है । ग) hemolymph आयल फिल्म पर लहूलुहान है । घ) hemolymph की ढाणी से 20-50 लार्वा को काँच की केशिका और nanoinjector के साथ लिया जाता है. ङ) hemolymph और hemocytes एक धिम के साथ गिना जा करने के लिए ५०० µ एल hemocytometer युक्त एक microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: vivo में संक्रमण । A) Drosophila फ्रूट जूस आगर प्लेट्स और यीस्ट पेस्ट का इस्तेमाल vivo संक्रमित लार्वा की मशीन के लिए किया जाता है । लार्वा की दीर्घायु (धूसर तीर) की सुविधा के लिए आगर प्लेट में कटौती की जाती है । ख) एक ०.००१ mm बताया टंगस्टन सुई आयल फिल्म का उपयोग कर संदंश से जुड़ा हुआ है । ग) ०.००१ मिमी की नोक टंगस्टन सुई बताया । घ) लार्वा स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत आयल फिल्म पर रोगज़नक़ पूल में टंगस्टन सुई के साथ चुभने है । ङ) चुभने वाले लार्वा को आगर प्लेट पर रखा जाता है. च) प्लेट आयल फिल्म के साथ बंद कर दिया और उचित समय तक कंटेनर में नम कागज तौलिए पर रखा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : hemocytes में रोगज़नक़ के आक्रमण के पार वर्गों । रोगाणु संक्रमित hemocytes के 3d फोकल स्कैनिंग से निकाले गए अनुभाग । A, B) xy-अनुभागों को hemocyte के भीतरी भाग में C. burnetii (सफ़ेद ऐरोहेड के साथ चिह्नित लाल में) दिखाता है । ग्रे ऐरोहेड hemocytes की नाभिक दिखाते हैं. एक ', एक ", बी ') yz सहित विचार-और xz-अनुभाग छवियां 2 अतिरिक्त देखने के अंक से hemocytes में सी. burnetii के आक्रमण को दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : hemocytes में रोगज़नक़ आक्रमण के 3 डी मॉडल । hemocytes में सी. burnetii आक्रमण के 3 डी मॉडल खंगाला पूर्व vivo और vivo में संक्रमण के बाद उत्पंन कर रहे हैं । मॉडल स्वतंत्र रूप से सॉफ्टवेयर का उपयोग कर घुमाया जा सकता है; यहाँ 6 देखने अंक हरे रंग में hemocyte के साथ दिखाया गया है, C. burnetii लाल (सफेद ऐरोहेड), और नीले रंग (ग्रे ऐरोहेड) में नाभिक. पार की धारा छवियों रोगज़नक़ के इंटीरियर पर हमला भी दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : प्रतिशत और लाइव hemocytes की जनसंख्या । Hemocytes १० ३ rd instar लार्वा के समूहों से निकाले गए Petraki एट अल की विधि का उपयोग कर । और यहां प्रस्तुत विधि । एक) लाइव hemocytes का प्रतिशत Trypan नीले अपवर्जन परख द्वारा प्रत्येक तकनीक के लिए गणना की गई थी । ख) hemocytes की कुल जनसंख्या की दो तकनीकों के बीच तुलना की गई । बार रेखांकन का प्रतिनिधित्व ± मानक विचलन N से = 10 निष्कर्षण और परख प्रकार की विधि प्रति जैविक प्रतिकृति । P-मान एक दो-पुच्छ छात्र के T-असमान प्रसरण को मानते हुए परीक्षण से संकेत मिले हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : निकाले hemocytes के चित्र hemolectin चालक का उपयोग कर । Hemocytes से निकाले गए थे डब्ल्यू१११८के ८० लार्वा; p {w [+ mc] = Hml-GAL4. Δ} 2, p {w [+ mc] = यूएएस-2xEGFP} AH2. Hml ड्राइव के लिए प्रवर्तक hemocytes संचारण में GAL4, जो EGFP प्रतिलेखन और अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए यूएएस बाँधता है. hemocytes तय कर रहे थे और DAPI के साथ दाग के रूप में पहले20वर्णित है । Hemocytes चैम्बर्ड coverslips पर बढ़ रहे हैं और अंतर हस्तक्षेप अनुबंध (उद्योग) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged. ब्लू चैनल नाभिक DAPI के साथ दाग से पता चलता है और ग्रीन चैनल hemocytes व्यक्त EGFP से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : qRT-पीसीआर और जेल ट्रो । IIV6-193R जीन की अभिव्यक्ति केवल IIV6-संक्रमित hemocytes में qRT-पीसीआर द्वारा मनाया जाता था । एक) 193R जीन अभिव्यक्ति आंतरिक नियंत्रण, RpII, और एक अनुपात के रूप में प्रस्तुत करने के लिए सामान्यीकृत था । नकली संक्रमित hemocytes के लिए चक्र संख्या मनमाने ढंग से 193R इन नमूनों में पता नहीं था के बाद से विश्लेषण के लिए ४० की अधिकतम चक्र संख्या के लिए सेट किया गया था. डेटा से अर्थ ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है N = 3 प्रति समूह जैविक प्रतिकृति । P मान इंगित करता है कि एक दो-पुच्छ छात्र का T-परीक्षण असमान प्रसरण मान रहा है । ख) qRT-पीसीआर उत्पाद agarose जेल ट्रो द्वारा दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण । लिस्टिरिया एंटीजन और actin की अभिव्यक्ति मॉक-एण्ड लिस्टिरिया-संक्रमित hemocytes में 3rd instar Drosophila लार्वा से 1, 2, और 4 एच के बाद संक्रमण (p.i.) का निर्धारण पश्चिमी सोख्ता द्वारा किया जाता है । कुल प्रोटीन सांद्रता Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा निर्धारित किया गया जेल के प्रत्येक लेन में लोड प्रोटीन की कुल मात्रा को सामान्य । hemocytes को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया इनोक्युलम एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

विधि लार्वा की औसत संख्या
hemocyte निष्कर्षण के लिए		 कुल hemocytes की औसत संख्या
hemolymph
केशिका निष्कर्षण
(इस विधि)		 १९२.४४ (SD: ८६.०५) ४.५६ एक्स 105 कोशिकाओं (एसडी: ५.८३ एक्स 105)
(सीमा: ७०-३९०, N = 25 परीक्षण) (सीमा: 1.20 x 105 -२.९५ x 106 कोशिकाओं)
व्यक्तिगत
लार्वा विच्छेदन		 २६.६७ (SD: ११.५५) ८.३३ एक्स 103 कोशिकाओं (एसडी: ६.६६ एक्स 103)
(सीमा: 20-40, एन = 10 परीक्षण) (सीमा: ४.०० x 103 -१.६० x 104 कोशिकाओं)
लार्वा
केशिका निष्कर्षण *		 N/A * N/A *
* hemocytes केशिका सुई के कॉलेस्ट्रॉल के कारण इस विधि का उपयोग कर निकाला जा करने में असमर्थ थे

तालिका 1: विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके विच्छेदित लार्वा और निकाले hemocytes की संख्या. विच्छेदित लार्वा और निकाले गए hemocytes की औसत संख्याओं की तुलना यहां प्रस्तुत की गई विधि और अंय विधियों के बीच की गई । हमारे विधि लार्वा और hemocytes की अधिक संख्या के संग्रह के परिणामस्वरूप । लार्वा केशिका निष्कर्षण विधि भी प्रयास किया गया था, लेकिन hemocytes केशिका टिप के कॉलेस्ट्रॉल के कारण निकाला जा करने में असमर्थ थे ।

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Discussion

बेहतर समझने के लिए कैसे मेजबान कोशिकाओं संक्रमित हो जाते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं में रोगज़नक़ के स्थानीयकरण स्पष्ट है, खासकर जब पहले untested रोगज़नक़ और सेल प्रकार संयोजन पर प्रयोग कर4। जबकि सेलुलर प्रतिक्रिया झरना का अध्ययन निंनलिखित संक्रमण उत्पादक रोगज़नक़ आक्रमण का संकेत कर सकते हैं, इमेजिंग और सेलुलर प्रतिक्रिया डेटा के संयोजन के लिए रोगज़नक़ आक्रमण और संक्रमण का प्रदर्शन आवश्यक है । जबकि मेजबान कोशिकाओं में रोगज़नक़ आक्रमण के 2 डी छवियों को दिखा रिपोर्ट उत्पादक संक्रमण इंगित करने के लिए जाता है, कुछ सवाल मेजबान कोशिकाओं में प्रारंभिक रोगज़नक़ आक्रमण के समय के बारे में रह सकते हैं । इस प्रकार, 3d मॉडल 2 डी छवियों की z-खंड स्कैनिंग से खंगाला इन सवालों का पता और मेजबान कोशिकाओं में रोगज़नक़ स्थान का संकेत कर सकते है (आंकड़े 4 और 5) । हालांकि, प्राथमिक hemocytes का उपयोग करने की एक सीमा सेल संस्कृति में उनकी लंबी उंर है । पिछले एक रिपोर्ट में कहा गया है कि सेल संस्कृति मीडिया में hemocyte अस्तित्व केवल 8 एच18है, और हमारे संक्रमण प्रोटोकॉल में, हम 24 घंटे तक परख करने में सक्षम थे, लेकिन अब नहीं । इसलिए, यह संभव नहीं था के उच्च स्तर पर गौर करने के लिए C. burnetii प्रतिकृतिकरण या parasitophorous vacuole के गठन जो शुरू नहीं करता है जब तक 2 दिनों के बाद संक्रमण और चौकसी बड़े नहीं है जब तक 4-6 दिनों के बाद संक्रमण30 .

कई प्रयोगों के लिए जहां समापन बिंदु परख विश्लेषण के लिए प्रोटीन या आरएनए का उपयोग, कोशिकाओं की बड़ी संख्या आमतौर पर पूछताछ के लिए पर्याप्त सामग्री का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, यहाँ, हम 3rd instar Drosophila लार्वा से व्युत्पंन प्राथमिक hemocytes में रोगज़नक़ संक्रमण की सीमा तक जांच करने के लिए पश्चिमी सोख्ता और qRT-पीसीआर जैसे समापन बिंदु विश्लेषण का उपयोग करें । इस प्रकार, यहां प्रस्तुत विधि तेजी से लार्वा विच्छेदन और पूर्व vivo रोगज़नक़ संक्रमण के लिए पर्याप्त रहते hemocytes युक्त hemolymph के संग्रह पर केंद्रित है । इस विधि के लिए एक nanoinjector के उपयोग का परिचय hemolymph और hemocytes जल्दी ले लो । 25% FBS युक्त धिम में hemocytes रखने hemocyte अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, पूर्व vivo संक्रमण के लिए यहां प्रस्तुत, hemocytes की एक बड़ी संख्या की जरूरत है । melanization31,३२,३३, विच्छेदन और hemocyte संग्रह से बचने के लिए तेजी से होने चाहिए । जबकि hemocyte निष्कर्षण के लिए अंय विधियों में मौजूद18,19,23, पूर्व vivo संक्रमण के लिए hemocytes की एक पर्याप्त बड़ी संख्या में इकट्ठा करने के लिए इन तरीकों की अवधि बहुत लंबा था । १०० µm ठीक टिप अंय अंगों कि केशिका सुई के कॉलेस्ट्रॉल के लिए नेतृत्व कर सकते है लेने के बिना hemolymph के ऊपर के लिए फायदेमंद है । एक nanoinjector का उपयोग भी स्वचालित हो सकता है जब यह एक micromanipulator चरण और पैर पेडल से जुड़ा हुआ है, उपयोगकर्ता की अनुमति के लिए Drosophila लार्वा के त्वरित विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित करने और समय है कि hemocytes आसपास के बिना कर रहे है कम लार्वा ऊतक या सेल संस्कृति मीडिया । फिर भी, एक पिपेट का उपयोग करने के लिए धिम को हस्तांतरण के लिए hemolymph तक ले उपलब्ध है । इसके अलावा, हमारे विधि anesthetize लार्वा को विच्छेदन करने से पहले के लिए2 CO गैस का उपयोग करता है; आयल फिल्म कवर के साथ एक कोल्ड ब्लॉक का उपयोग एक और व्यवहार्य विधि23है । अंत में, hemolymph की रिहाई के दौरान धिम की एक बूंद में लार्वा की विच्छेदन hemocytes की संख्या कम हो सकती है कि तेल फिल्म से चिपके हुए हैं, लेकिन केशिका सुई द्वारा ऊपर उठाने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी ।

चोट है, जो खोलने और लार्वा छल्ली के विच्छेदन के दौरान होता है के लिए Drosophila में एक आम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया melanization31,३२,३३है । hemocytes के निष्कर्षण के दौरान, हम धिम में hemocytes के melanization के रूप में जल्दी के रूप में 10 मिनट के बाद निष्कर्षण का पालन करेंगे । के रूप में melanization एक तेजी से प्रक्रिया है, इन कोशिकाओं रोगज़नक़ संक्रमण प्रयोगों से बाहर रखा जाएगा । इसके अतिरिक्त, एंटी-कौयगुलांट phenylthiourea धिम को phenoloxidase-सक्रिय करने की प्रणाली और melanization को बाधित करने के लिए जोड़ा जा सकता है9। फिर भी, के रूप में melanization और apoptosis के रूप में Drosophilaकी जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं रहे हैं, अपने स्तर hemocyte निष्कर्षण और उत्तेजना के बाद quantified किया जा सकता है यहां वर्णित विधियों का उपयोग कर ।

जबकि प्रोटीन या आरएनए सामग्री की बड़ी मात्रा में उबरने पश्चिमी दाग और qRT-पीसीआर जैसे तकनीकों के लिए एक आवश्यकता है, RNAseq के रूप में नई तकनीक, बहुत कम इनपुट सामग्री की आवश्यकता होती है, के रूप में छोटे के रूप में 10 एक एकल सेल से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए के स्नातकोत्तर३४। इन के रूप में प्रयोग दिलचस्प प्रयोगात्मक प्रश्न उठाएं, और के बाद से Drosophila hemocytes एक विषम क्रिस्टल कोशिकाओं, plasmatocytes, और lamellocytes7युक्त जनसंख्या हैं, एक से पूछताछ शुरू कर सकता है प्रत्येक कक्ष प्रकार३५का transcriptional प्रतिसाद । उदाहरण के लिए, Kurucz एट अल., एंटीबॉडी कि transcriptional या proteomic विभिन्न उत्तेजनाओं के बाद रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि Drosophila hemocyte उपसमुच्चय को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया है. इसके अतिरिक्त, एक सेल RNAseq प्रौद्योगिकी के हाल के विकास के लिए एंटीबॉडी के उपयोग के बिना प्रत्येक कोशिका प्रकार के transcriptomes को परिभाषित करने के लिए शुरू में प्रत्येक कोशिका प्रकार को अलग कर सकता है३६,३७,३८, ३९. इसके अलावा, एक hemocyte उपसमुच्चय में जीन विनियमन के बारे में सवाल पूछ सकते है कि मदद कर सकता है हमें समझ कैसे मानव रक्त कोशिका वंश उत्पत्ति और तुलनात्मक जीनोमिक्स प्रयासों के माध्यम से प्राचीन जीवों से विकसित । इन के रूप में समस्याओं से निपटने प्रयोगात्मक तकनीक की एक विस्तृत श्रृंखला के संयोजन की आवश्यकता है, और तकनीक यहां वर्णित इस तरह के प्रयासों के लिए उपयोगी हो सकता है जब invertebrate लार्वा से hemocytes की एक बड़ी संख्या के अलगाव की आवश्यकता है ।

यहां, हम संक्रमण की पुष्टि के लिए संख्यात्मक, जैव रासायनिक डेटा के साथ 3 डी मॉडल के संयोजन का सुझाव देते हैं । भविष्य के अध्ययनों में, हम यहां वर्णित तरीकों का उपयोग कर सकते है प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पालन करें और सह द्वारा मेजबान कोशिकाओं में रोगज़नक़ आक्रमण के तंत्र-माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए मेजबान प्रोटीन धुंधला ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम mCherry-एक्सप्रेस Coxiella burnetiiके स्टॉक्स प्रदान करने के लिए डॉ रॉबर्ट Heinzen के आभारी हैं । हम Invertebrate इंद्रधनुषी वायरस 6 प्रदान करने के लिए Dr. Luis Teixeira और ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र फ्लाई स्टॉक प्रदान करने के लिए धंयवाद । इस परियोजना के हिस्से में NIH ग्रांट R00 AI106963 (A.G.G. को) और वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३५ रोगज़नक़ आक्रमण hemocyte निष्कर्षण फोकल माइक्रोस्कोपी Coxiella burnetii लिस्टिरिया monocytogenes Invertebrate इंद्रधनुषी वायरस-6 IIV6
माइक्रोबियल संक्रमण और विश्लेषण के लिए <em>Drosophila melanogaster</em> लार्वा से Hemocytes का निष्कर्षण
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Hiroyasu, A., DeWitt, D. C.,… More

Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

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