مكافئات الأنسجة البشرية التحريضية ثلاثية الأبعاد للثة
Summary
وهدف البروتوكول بناء نموذج التهاب لثة بشرية في المختبر. هذا نموذج الأنسجة المزروعة شارك ثلاثة أنواع من الخلايا البشرية والخلايا الكيراتينيه هاكات والليفية اللثة والضامة THP-1، تحت ظروف ثلاثي الأبعاد. يمكن تطبيق هذا النموذج على التحقيق في أمراض اللثة، مثل التهاب اللثة والتهاب اللثة.
Abstract
أمراض اللثة (مثل التهاب اللثة والتهاب اللثة) هي الأسباب الرئيسية لفقدان الأسنان لدى البالغين. التهاب اللثة هو الفيزيولوجيا المرضية الأساسية لأمراض اللثة. تم إنشاء النماذج التجريبية الحالية لأمراض اللثة في أنواع مختلفة من الحيوانات. الفيزيولوجيا المرضية لنماذج حيوانية غير مختلفة عن البشر، مما يجعل من الصعب تحليل الآليات الجزيئية والخلوية، وتقييم الأدوية الجديدة لأمراض اللثة. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتعمير مكافئات الأنسجة البشرية التهاب اللثة (إيجتي) في المختبر. أولاً نبني مكافئات الأنسجة البشرية من لثة (GTE) باستخدام نوعين من الخلايا البشرية، بما في ذلك الخلايا الليفية اللثة البشرية (هجف) وجلد الإنسان البشرة الكيراتينيه (هاكات)، تحت ظروف ثلاثي الأبعاد. نحن خلق نموذج جرح باستخدام تثقيب أنسجة لكمه ثقب في GTE. يتم حقن وحيدات THP-1 المقبل، البشرية مختلطة مع جل الكولاجين في الحفرة في GTE. قبل أديميستراتيون من 10 نانوغرام/مل phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ح 72، THP-1 خلايا متباينة في الضامة للنموذج البؤر الملتهبة في GTE (إيجتي) (إيجتي كما يمكن أن يكون ستوميلاتيد مع 2 ميكروغرام/مل من ليبوبوليساكتشاريديس (LPS) عن 48 ساعة لبدء التهاب ). إيجتي هو أول نموذج في المختبر لالتهاب اللثة باستخدام الخلايا البشرية مع بنية ثلاثية الأبعاد. إيجتي يعكس التغييرات المرضية الرئيسية (اكتيفيشن إيمونوسيتيس، والتفاعلات داخل الخلايا بين فيبريوبلاستس والخلايا الظهارية ووحيدات والضامة) في أمراض اللثة. GTE و GTE الجرحى إيجتي يمكن استخدامها كأدوات متعددة لدراسة التئام الجروح وتجديد الأنسجة والتهاب، التفاعل خلية خلية وشاشة الأدوية المحتملة لأمراض اللثة.
Introduction
أمراض اللثة هي السبب الرئيسي لفقدان الأسنان لدى البالغين. التهاب اللثة والتهاب اللثة هي أمراض اللثة الأكثر شيوعاً. كل هذا التغييرات الالتهابات الحادة أو المزمنة بيوفيلم بوساطة في اللثة. التهاب اللثة يتميز بالتهاب حاد، بينما التهاب اللثة ويعرض عادة كالتهاب مزمن. على المستوى النسيجي، مكونات بكتيرية تؤدي إلى تنشيط الخلايا المناعية، مثل الضامة والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما وخلايا ماست1،2. هذه الخلايا المناعية، وبخاصة الضامة، تتفاعل مع الخلايا المحلية (بما في ذلك الخلايا الظهارية اللثة والخلايا الليفية، وخلايا بطانية وخلايا الاوستيوبلاستس) أدى إلى آفات التهاب في أنسجة اللثة3،4. تم إنشاء نماذج تجريبية لأمراض اللثة في أنواع مختلفة من الحيوانات مثل الفئران، الهامستر والأرانب، فرت، الأنياب والرئيسات. الفيزيولوجيا المرضية لنماذج حيوانية غير مختلفة عن البشر، مما يجعل من الصعب تحليل الآليات الجزيئية والخلوية، وتقييم الأدوية الجديدة لأمراض اللثة5. وقد استخدمت المشارك زراعة اللثة البكتيريا والخلايا الظهارية الشفوي البشري أحادي الطبقة التحقيق إليه التهابات اللثة6. ومع ذلك، تفتقر ثقافات أحادي الطبقة من الخلايا عن طريق الفم هندسة الأنسجة سليمة؛ الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) ولذلك، أنهم لا يمكن أن تحاكي الحالة في المختبر .
وهنا تنشأ مكافئات 3D الأنسجة البشرية التهاب اللثة (إيجتي) لتمثل أمراض اللثة في المختبر. هذا نموذج ثلاثي الأبعاد من أمراض اللثة تحتل موقعا وسيطة بين الثقافات الخلية أحادي الطبقة ونماذج حيوانية. ثلاثة أنواع من الخلايا البشرية، بما في ذلك الخلايا الكيراتينيه هاكات واللثة الليفية الضامة THP-1، يزرع شارك في جل الكولاجين، وتحفزها المبادرين التحريضية لبناء إيجتي. إيجتي يحاكي عن كثب الأوضاع في فيفو الخلية التمايز والتفاعل خلية خلية التنشيط بلعم في اللثة. هذا النموذج قد العديد من التطبيقات الممكنة للمخدرات فحص واختبار النهج الجديدة الدوائي في أمراض اللثة، وكذلك لتحليل الآليات الخلوية والجزيئية في التئام الجروح والالتهابات، وتجديد الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند هذا البروتوكول أساليب إنشاء معادلات أنسجة اللثة ومكافئات الأنسجة الدهنية تحت الجلد الموصوفة بالتقارير السابقة8،،من2122. على الرغم من أن هذا أسلوب بسيط وسهل، بعض الخطوات تتطلب اهتماما خاصا. على سبيل المثال، ينبغي أن يوضع الخليط الك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيد جزئيا “مجتمع اليابان” لمعونات النهوض بالعلوم (JSPS) “البحوث العلمية” (ك 26861689 و 17 11813). المؤلف يود أن يشكر السيد ناثانيل غرين لتصحيح التجارب المطبعية.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
References
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
- Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
- Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
- Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
- Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
- Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
- Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
- Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).
