Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive
Summary
L’objectif du protocole est de construire un modèle d’inflammatoire gencive humaine in vitro. Ce modèle de tissu co cultive trois types de cellules humaines, HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, dans des conditions en trois dimensions. Ce modèle peut être appliqué à une enquête sur les maladies parodontales, telles que la gingivite et la parodontite.
Abstract
Les maladies parodontales (telles que la gingivite et la parodontite) sont les principales causes de la perte des dents chez les adultes. Inflammation de la gencive est la fondamentale physiopathologie des maladies parodontales. Les modèles expérimentaux actuels des maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments pour les maladies parodontales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour reconstruire les équivalents humains inflammatoires des tissus de la gencive (iGTE) in vitro. Nous avons tout d’abord créer des équivalents de tissus humains de la gencive (GTE) en utilisant deux types de cellules humaines, y compris les fibroblastes gingivaux humains (HGF) et les kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT), dans des conditions en trois dimensions. Nous créons un modèle de la plaie à l’aide d’un perforateur de tissu pour percer un trou dans le GTE. Ensuite, humaines monocytes THP-1 mélangés avec du gel de collagène sont injectées dans le trou dans le GTE. Par adimistration de 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pendant 72 h, THP-1 cellules se différencient en macrophages aux foyers inflammatoires de la forme en GTE (iGTE) (IGTE peut également être stumilated avec 2 µg/mL de lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 h initier l’inflammation ). IGTE est le premier modèle in vitro de la gencive inflammatoire utilisant des cellules humaines avec une architecture en trois dimensions. IGTE reflète des changements pathologiques principaux (immunocytes activition, interactions intracellulaires chez les fibryoblasts, les cellules épithéliales, les monocytes et les macrophages) dans les maladies parodontales. GTE, GTE blessé et iGTE utilisable comme outils polyvalents pour étudier la cicatrisation, régénération des tissus, l’inflammation, interaction cellule-cellule et médicaments potentiels écran des maladies parodontales.
Introduction
Les maladies parodontales sont la principale cause de la perte des dents chez les adultes. La gingivite et la parodontite est des maladies parodontales les plus courantes. Les deux induite par le biofilm aiguës ou chroniques inflammatoires changements actuels dans la gencive. La gingivite est caractérisée par une inflammation aiguë, tandis que la parodontite se présente généralement comme une inflammation chronique. Sur le plan histologique, les composantes bactériennes déclenchent l’activation des cellules immunitaires, tels que les macrophages, lymphocytes, plasmocytes et mastocytes1,2. Ces cellules immunitaires, en particulier les macrophages, interagissent avec les cellules locales (y compris les cellules épithéliales gingivales, fibroblastes, cellules endothéliales et les ostéoblastes) entraînant des lésions inflammatoires dans les tissus parodontaux3,4. Modèles expérimentaux de maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux, comme les rats, hamsters, lapins, furets, chiens et des primates. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments des maladies parodontales5. Co-culture de bactéries parodontales et cellules épithéliales humaines orale de monocouche a été utilisé pour étudier le mécanisme de l’infection parodontale6. Néanmoins, des cultures monocouches de cellules par voie orale n’ont pas l’architecture cellulaire d’en trois dimensions (3D) de tissus intacts ; par conséquent, ils ne peuvent pas imiter la situation in vitro .
Ici, équivalents 3D inflammatoires des tissus humains de la gencive (iGTE) sont mis en place pour représenter les maladies parodontales in vitro. Ce modèle 3D des maladies parodontales occupe une position intermédiaire entre des cultures monocouches de cellules et des modèles animaux. Trois types de cellules humaines, y compris HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, sont conjointement cultivés sur gel de collagène et stimulées par les initiateurs inflammatoires de construire iGTE. IGTE simule étroitement les conditions in vivo de la différenciation cellulaire, interaction cellule-cellule et activation des macrophages dans la gencive. Ce modèle a de nombreuses applications possibles pour drogue préliminaire et d’essai de nouvelles approches pharmacologiques dans les maladies parodontales, ainsi que pour analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires dans la guérison des blessures, l’inflammation et la régénération des tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est basé sur les méthodes de création d’équivalents de tissu gingival et les équivalents de-le tissu adipeux sous-cutané décrits par les précédents rapports8,21,22. Bien qu’il s’agit d’une méthode simple et facile, certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, le mélange collagène doit être maintenu sur la glace jusqu’à l’utilisation afin d’éviter la formation de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par la société japonaise pour la subvention Promotion of Science (JSPS) pour la recherche scientifique (26861689 et 17 K 11813). Les auteurs tiennent à remercier M. Nathaniel Green pour la relecture.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
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