Equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva
Summary
O objetivo do protocolo é construir um modelo de gengiva humana inflamatória em vitro. Este modelo de tecido co cultiva três tipos de células humanas, HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e macrófagos THP-1, sob condições tridimensionais. Este modelo pode ser aplicado para investigar doenças periodontais, como gengivite e periodontite.
Abstract
Doenças periodontais (tais como gengivite e periodontite) são as principais causas de perda dentária em adultos. Inflamação na gengiva é fundamental fisiopatologia das doenças periodontais. Atuais modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos para doenças periodontais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reconstruir equivalentes de tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) em vitro. Primeiro construímos equivalentes de tecido humano da gengiva (GTE), utilizando dois tipos de células humanas, incluindo fibroblastos gengivais humanos (HGF) e pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT), sob condições tridimensionais. Criamos um modelo de ferida usando um furador de tecido para fazer um buraco na GTE. Em seguida, humanos monócitos THP-1 misturados com gel de colágeno são injetados no furo do GTE. Por adimistration de 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) para 72 h, THP-1 células diferenciadas em macrófagos aos focos inflamatórios da forma no GTE (iGTE) (IGTE também pode ser stumilated com 2 µ g/mL de lipopolissacarídeos (LPS) para 48 h iniciar a inflamação ). IGTE é o primeiro em vitro modelo da gengiva inflamatória usando células humanas com uma arquitetura tridimensional. IGTE reflete grandes mudanças patológicas (immunocytes activition, interações intracelulares, entre fibryoblasts, células epiteliais, monócitos e macrófagos) em doenças periodontais. GTE, GTE ferido e iGTE podem ser usados como ferramentas versáteis para estudar a cicatrização de feridas, regeneração tecidual, inflamação, interação célula-célula e tela potenciais medicamentos para as doenças periodontais.
Introduction
As doenças periodontais são a principal causa de perda dentária em adultos. Gengivite e periodontite é as doenças periodontais mais comuns. Ambos apresentam alterações inflamatórias mediada por biofilme agudas ou crônicas na gengiva. A gengivite é caracterizada por inflamação aguda, Considerando que a periodontite apresenta-se geralmente como uma inflamação crônica. A nível histológico, componentes bacterianas desencadear a ativação de células do sistema imunológico, tais como macrófagos, linfócitos, plasmócitos e mastócitos1,2. Estas células imunes, especialmente os macrófagos, interagirem com as células locais (incluindo células epiteliais gengivais, fibroblastos, células endoteliais e osteoblastos) resultando em lesões inflamatórias no tecido periodontal3,4. Modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais, como ratos, hamsters, coelhos, furões, caninos e primatas. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos de doenças periodontais5. Co de cultivo de bactérias periodontais e células epiteliais oral humanas monocamada serviu para investigar o mecanismo das infecções periodontais6. No entanto, culturas de monocamadas de células orais faltam a arquitetura de celulares tridimensional (3D) do tecido intacto; Portanto, eles não podem imitar a situação em vitro .
Aqui, equivalentes 3D tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) são criados para representar doenças periodontais em vitro. Este modelo 3D das doenças periodontais ocupa uma posição intermediária entre as culturas de células monocamadas e modelos animais. Três tipos de células humanas, incluindo HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e THP-1 macrófagos, são co cultivados em gel de colágeno e estimulados pela inflamatórios iniciadores para construir iGTE. IGTE intimamente simula as condições na vivo de diferenciação celular, interação célula-célula e ativação de macrófagos na gengiva. Este modelo tem muitas aplicações possíveis drogas triagem e testando novas abordagens farmacológicas em doenças periodontais, bem como para analisar os mecanismos celulares e moleculares na cicatrização de feridas, inflamação e regeneração de tecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é baseado em métodos de criação de equivalentes de tecido gengival e equivalentes de tecido adiposo subcutâneos descritos por anteriores relatórios8,21,22. Embora este seja um método simples e fácil, algumas etapas requerem atenção especial. Por exemplo, a mistura de colágeno deve ser mantida no gelo até o uso para evitar a formação de gel na solução. Ao adicionar a mistura de colágeno para a inse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pela sociedade do Japão para o promoção da ciência (JSPS) subsídio para a investigação científica (26861689 e 17 K 11813). Os autores gostaria de agradecer o Sr. Nathaniel Green para revisão.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
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