Summary

歯肉の炎症性三次元人体同等

Published: April 03, 2018
doi:

Summary

プロトコルの目的は、炎症性歯肉モデル体外を構築することです。この組織モデルは共同ひと細胞、HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞および三次元条件下での THP 1 マクロファージの 3 種類を栽培します。このモデルは、歯肉炎や歯周炎などの歯周病を調査に適用することができます。

Abstract

(歯肉炎・歯周炎などの歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉の炎症は、歯周疾病の根本的な生理病理学です。歯周疾患の実験モデルを現在は動物の様々 なタイプに設けられています。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患の新薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。ここでは、ヒトの炎症性組織培養歯肉 (日本支社は 1996) 相当を再構築するための詳細なプロトコルを提案する.2 種類のひと歯肉線維芽細胞 (HGF) と三次元条件下でヒトの皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) などを含む人間の細胞を用いた人体組織等価な歯肉 (GTE) を構築します。GTE に穴をパンチする組織パンチャーを使用して傷のモデルを作成します。次に、人間の THP 1 球がコラーゲン ・ ゲル混合は、GTE の穴に挿入されます。10 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 72 時間の adimistration、thp-1 細胞では GTE (日本支社は 1996) でフォーム炎症巣にマクロファージ分化 (日本支社は 1996 もすることができます stumilated 2 μ g/ml のリポ多糖 (LPS) の炎症を開始する 48 時間).日本支社は 1996 は、ひと細胞を用いた三次元アーキテクチャ炎症歯肉の最初の in vitroモデルです。日本支社は 1996 は、歯周疾病の主要な病理学的変化 (免疫細胞 activition、fibryoblasts、上皮細胞、単球やマクロファージの細胞相互作用) を反映します。GTE、負傷者 GTE、日本支社は 1996 は、歯周疾病の創傷治癒過程を研究する汎用性の高いツール、組織再生、炎症、細胞間相互作用や画面潜在的な医薬品として使用できます。

Introduction

歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉炎と歯周炎は、最も一般的な歯周疾患です。両方は歯肉でバイオ フィルムを介した急性または慢性炎症性変化を提示します。歯肉炎は、歯周炎は、通常慢性炎症として提示に対し、急性炎症によって特徴付けられます。組織学的レベルでは、微生物の構成要素は、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、肥満細胞の1,2などの免疫細胞の活性化をトリガーします。(歯肉上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞を含む) ローカルの細胞と対話するこれらの免疫細胞、特にマクロファージ炎症歯周組織3,4病変の結果します。ラットなどの動物の様々 な種類の歯周疾患の実験モデルを確立されているハムスター、ウサギ、フェレット、イヌ、霊長類。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患5の新しい薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。歯周病細菌や単分子膜ひと口腔上皮細胞の共同栽培は、歯周感染症6のメカニズムを調査する使用されています。口腔細胞の単層培養がそのまま組織の三次元 (3 D) 細胞アーキテクチャを欠いているにもかかわらず、したがって、培養状況を模倣することはできません。

ここでは、体外で歯周疾患を表す 3 D 炎症人体組織等価な歯肉 (日本支社は 1996) が確立されます。歯周疾患のこの 3 D モデルは、単層細胞培養および動物モデル間の中間位置を占めています。HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞、THP 1 マクロファージなどの細胞の 3 種類はコラーゲンのゲルの共同栽培、日本支社は 1996 を構築する炎症性のイニシエーターによって刺激されます。日本支社は 1996 は密接に、細胞分化、細胞間の相互作用、および歯肉組織におけるマクロファージ活性化の生体内での条件をシミュレートします。このモデルは、薬物スクリーニングと歯周疾病の新しい薬理学的アプローチをテストのためだけでなく、創傷治癒、炎症、組織再生で細胞および分子メカニズムを分析するため多くのアプリケーションを持っています。

Protocol

このプロトコルは、対応するひと歯肉組織、歯肉創傷モデル、および歯肉炎モデルを作成する設計されています。ひと皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) 親切教授ノルベルト ・ e. Fusenig ドイツ Krebsforschungszentrum (ハイデルベルク、ドイツ)7から提供されていました。ひと歯肉線維芽細胞 (HGFs) は、以前に公開されたプロトコル8によると歯肉組織から分離された.あらか?…

Representative Results

細胞には、位相差顕微鏡による観察 (図 2 a) の下で典型的な表皮細胞の形態が表示されます。スキャナー電子顕微鏡 (SEM) 像は、HaCaT 細胞表面が多く微絨毛で覆われていたことを示した。HaCaT 細胞間の細胞間の接続は、膜プロセス (図 2 b) によって仲介されました。細胞は、歯肉上皮マーカー K8/1814HaCaT 細胞…

Discussion

このプロトコルは、歯肉組織等価および皮下脂肪組織相当前レポート8,21,22で説明を作成する方法に基づいています。これは、シンプルで簡単な方法は、いくつかの手順特別な注意が必要です。たとえば、コラーゲン混合物は、ソリューションのゲル形成を避けるために使用するまで氷で冷やす必要があります。コラーゲ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、科学研究 (26861689, 17 K 11813) の科学振興費日本社会によって一部に支えられました。著者は、校正のナサニエル ・ グリーン氏に感謝したいと思います。

Materials

Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

References

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Cite This Article
Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

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