तीन आयामी भड़काऊ मानव ऊतक Gingiva के समकक्ष
Summary
प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन विट्रो मेंएक भड़काऊ मानव gingiva मॉडल का निर्माण करने के लिए है । यह ऊतक मॉडल सह तीन आयामी परिस्थितियों के तहत मानव कोशिकाओं, HaCaT keratinocytes, मसूड़ों fibroblasts, और THP-1 मैक्रोफेज, के तीन प्रकार की खेती । इस मॉडल ऐसे मसूड़े की सूजन और periodontitis के रूप में periodontal रोगों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है ।
Abstract
Periodontal रोग (जैसे मसूड़े की सूजन और periodontitis) वयस्कों में दांत नुकसान के प्रमुख कारण हैं । gingiva में सूजन periodontal रोगों के बुनियादी physiopathology है । periodontal रोगों के वर्तमान प्रयोगात्मक मॉडल जानवरों के विभिन्न प्रकार में स्थापित किया गया है । हालांकि, पशु मॉडलों की physiopathology है कि मनुष्यों से अलग है, यह मुश्किल सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए और periodontal रोगों के लिए नई दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए बना । यहां, हम मानव भड़काऊ ऊतक gingiva के समकक्ष (iGTE) इन विट्रो मेंपुनर्निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम पहले मानव मसूड़ों fibroblasts (एचजीएफ) और मानव त्वचा एपिडर्मल keratinocytes (HaCaT), तीन आयामी परिस्थितियों के तहत सहित मनुष्य कोशिकाओं के दो प्रकार के उपयोग द्वारा gingiva (GTE) के मानव ऊतक समकक्ष का निर्माण । हम एक ऊतक पंच का उपयोग करके एक घाव मॉडल बनाने के लिए GTE में एक छेद पंच । अगले, मानव THP-1 कोलेजन जेल के साथ मिश्रित monocytes GTE में छेद में इंजेक्ट कर रहे हैं । के adimistration द्वारा 10 एनजी/एमएल phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) के लिए 72 ज, THP-1 कोशिकाओं मैक्रोफेज में भड़काऊ घावों फार्म करने के लिए GTE (iGTE) में विभेदित (iGTE भी हो सकता है stumilated के साथ 2 µ g/mL (lipopolysaccharides) के लिए 48 h सूजन शुरू करने के लिए ). IGTE एक तीन आयामी वास्तुकला के साथ मानव कोशिकाओं का उपयोग भड़काऊ gingiva के इन विट्रो मॉडल में पहला है । IGTE periodontal रोगों में प्रमुख रोग परिवर्तन (immunocytes activition, fibryoblasts, उपकला कोशिकाओं, monocytes और मैक्रोफेज के बीच intracellular बातचीत) को दर्शाता है । GTE, घायल GTE, और iGTE बहुमुखी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है घाव भरने का अध्ययन, ऊतक पुनर्जनन, सूजन, सेल सेल संपर्क, और स्क्रीन periodontal रोगों के लिए संभावित दवाओं ।
Introduction
Periodontal रोग वयस्कों में दांत नुकसान का प्रमुख कारण हैं । मसूड़े की सूजन और periodontitis सबसे आम periodontal रोग हैं । दोनों वर्तमान फिल्म gingiva में तीव्र या जीर्ण भड़काऊ परिवर्तन मध्यस्थता । मसूड़े की सूजन तीव्र सूजन की विशेषता है, जबकि periodontitis आमतौर पर जीर्ण सूजन के रूप में प्रस्तुत करता है । ऊतकवैज्ञानिक स्तर पर, बैक्टीरियल घटक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण ट्रिगर, जैसे मैक्रोफेज, लिम्फोसाइटों, प्लाज्मा कोशिकाओं, और मस्तूल कोशिकाओं1,2. इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से मैक्रोफेज, (मसूड़ों उपकला कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, और osteoblasts सहित) periodontal ऊतक में भड़काऊ घावों में जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय कोशिकाओं के साथ बातचीत3,4. periodontal रोगों के प्रयोगात्मक मॉडल जैसे चूहों, हंसटर, खरगोश, ferrets, कुत्ते, और रहनुमाओं के रूप में पशुओं के विभिन्न प्रकार में स्थापित किया गया है । हालांकि, पशु मॉडलों की physiopathology है कि मनुष्यों से अलग है, यह मुश्किल सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण करने और periodontal रोगों की नई दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए5। periodontal जीवाणुओं और monolayer मानव मौखिक उपकला कोशिकाओं की सह खेती periodontal संक्रमण के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है6. फिर भी, मौखिक कोशिकाओं की monolayer संस्कृतियों बरकरार ऊतक के तीन आयामी (3 डी) सेलुलर वास्तुकला की कमी; इसलिए, वे इन विट्रो स्थिति में नकल नहीं कर सकते ।
यहां, 3 डी भड़काऊ मानव ऊतक gingiva के समकक्ष (iGTE) इन विट्रो मेंperiodontal रोगों का प्रतिनिधित्व करने के लिए स्थापित कर रहे हैं । periodontal रोगों के इस 3 डी मॉडल monolayer सेल संस्कृतियों और जानवरों के मॉडल के बीच एक मध्यवर्ती स्थिति में रह रहे हैं । HaCaT keratinocytes, मसूड़ों fibroblasts, और THP-1 मैक्रोफेज सहित मानव कोशिकाओं के तीन प्रकार, सह कोलेजन जेल पर खेती कर रहे हैं, और भड़काऊ सर्जक द्वारा उत्तेजित करने के लिए iGTE का निर्माण । IGTE बारीकी से सेल भेदभाव, सेल सेल संपर्क, और gingiva में मैक्रोफेज सक्रियण की vivo स्थितियों में simulates । इस मॉडल दवा स्क्रीनिंग के लिए कई संभव आवेदन किया है और periodontal रोगों में नए औषधीय दृष्टिकोण का परीक्षण, साथ ही साथ घाव भरने में सेलुलर और आणविक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए, सूजन, और ऊतक पुनर्जनन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल पिछले रिपोर्ट8,21,22द्वारा वर्णित मसूड़ों ऊतक समकक्ष और चमड़े के नीचे वसा-ऊतक समकक्ष बनाने के तरीकों पर आधारित है । हालांकि यह एक सरल और आसान तरीका है, कुछ क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया (JSPS) अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (२६८६१६८९ और 17K11813) । लेखकों को ठीक करने के लिए श्री Nathaniel ग्रीन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
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