التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون
Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية تصور الضغط الحمض النووي عابر في البكتيريا الزرقاء. زراعة متزامنة، رصد المجهري الأسفار، والتجميد السريع، وعالية تستخدم التصوير المقطعي الإلكترون البرد الجهد. ويرد بروتوكول لهذه المنهجيات، وتناقش التطورات والتطبيقات المستقبلية.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول كيفية تصور الضغط الحمض النووي عابر في البكتيريا الزرقاء. انضغاط الحمض النووي حدث هيولى مثيرة مؤخرا أنها تحدث في بعض البكتيريا الزرقاء قبل انقسام الخلية. ومع ذلك، نظراً لحجم الخلية الكبيرة والطابع عابر، من الصعب التحقيق في هيكل بالتفصيل. للتغلب على الصعوبات، أولاً، انضغاط الحمض النووي هو تكاثر في سيانوباكتيريوم الونجاتوس سينيتشوكوككوس PCC 7942 التي تنتجها الثقافة متزامن باستخدام 12 ح كل دورة الضوء/الظلام. الثاني، ضغط الحمض النووي تخضع للفحص المجهري الأسفار واستولت عليها التجميد السريع. ثالثا، ضغط مفصلة بنية الحمض النووي الخلايا هو متصور في الأبعاد الثلاثة (3D) بالتصوير المقطعي الإلكترون البرد الجهد العالي. هذه المجموعة من الأساليب التطبيق على نطاق واسع التحقيق فيها الهياكل عابر في البكتيريا، مثل انقسام الخلية، العزل الصبغي، والعدوى بالعاثية إلخ.، التي تخضع للفحص المجهري الأسفار وتصور مباشرة من التصوير المقطعي بالبرد-إلكترون عند نقطة في الوقت المناسب.
Introduction
انضغاط الحمض النووي هو حدث هيولى مثيرة التي تم تحديدها في بعض البكتيريا. وتشير1عندما الونجاتوس سينيتشوكوككوس وكان مثقف تحت 12 ح كل دورة الضوء/الظلام، الحمض النووي يبدو مكثف في نهاية فترة الضوء، الذي كان واضحا مختلفاً عن مظهره وقت آخر. قيل أن هذه العملية يسيطر على مدار ساعة الإيقاعية استناداً إلى البروتينات كاي2. أفادت سيكي et al. أن الحمض النووي ملطخة هويشت 33342 ضغط في الخلايا الونجاتوس س. نهاية فترة الخفيفة وأظهرت شكل قضيب مائج تحت مجهر الأسفار. ثم فصل الحمض النووي المضغوطة إلى قسمين في مركز قضيب كخلية مقسمة، وعاد أخيرا إلى توزيع موحدة عادية في كل خلية ابنه3. ولكن طبيعته عابر والحجم الكبير الميكروسكوب الإلكتروني تعوق التحليل الهيكلي. موراتا et al. الجمع بين عدة طرق، بما في ذلك الثقافة متزامن ومجهرية الأسفار، والتجميد السريع وعالية الجهد إلكترون cryo-التصوير المقطعي (cryo-هفت)، ونجحت في تحديد هيكل عابر الحمض النووي الضغط، بما في ذلك حركية وميلامين متعدد الفوسفات الهيئات (المدنيتين)4. المخطوطة شرح البصرية لمادة صعبة بالتفصيل حسب الجمع بين الإجراءات التجريبية.
الونجاتوس س. وقد شكل كبسولة، بطول من 2 إلى 5 ميكرون وعرض حول 0.5 ميكرومتر وانضغاط الحمض النووي الكمال يظهر في الخلايا الحية إلا لفترة زمنية قصيرة جداً. ولذلك، التغيرات الهيكلية التي تحدث في الضغط الحمض النووي سيانوباكتيريال لم تكن معروفة بالتفصيل. من أجل التحقيق في هذه الهياكل بالمجهر الإلكتروني، من الضروري للتغلب على المشاكل التقنية الرئيسية اثنين. واحد هو مراقبة مثل هذه العينة سميكة من بكتيريا كله في القرب من الشروط الأصلية، والآخر هو التثبيت السريع من بنية ديناميكية. أما بالنسبة للمشكلة الأولى، المسار الحر يعني غير مرن (إيمفب) للإلكترونات يعتمد على الجهد المتسارع ل المجهر الإلكتروني5. في مجهر إلكتروني انتقال (TEM) من 300 كيلو فولت، هو أقل من 350 نانومتر. على سبيل المثال، عند سيانوباكتيريوم جزءا لا يتجزأ من الجليد (≈ سمك العينة 600 nm) يلاحظ في تيم 200kV (إيمفب ≈ 250 نانومتر)، الهياكل داخل الخلية ويصعب مراقبة. على النقيض من ذلك، 1 أم تيم (إيمفب ≈ 500 نانومتر) يمكن إعطاء وصورة لهيكل هيولى في جميع أنحاء الخلية (الشكل 1). في هذا البروتوكول، كجزء من الحل، مجهر إلكتروني جهد العالي (هفيم) في جهد متسارع من 1 أم كان يعمل. غير أن المرافق التي تقوم بتنفيذ هفيم محدودة في جميع أنحاء العالم. وتناقش أيضا في قسم مناقشة الحلول البديلة الممكنة. تم حل المشكلة الثانية بالميكروسكوب الإلكتروني cryo (cryo-م). هذا أداة قوية لتصور الهياكل الحيوية في القرب من الشروط الأصلية، يتم تجميد العينة سريعاً في الإيثان السائل باستخدام جهاز تجميد سريع، حيث لوحظ لحظة المجمدة مباشرة مع الحد أدنى من التعديلات6. الجمع بين التصوير المقطعي، يمكن بناؤها لقطة ثلاثية الأبعاد (3D) هياكل من سلسلة إمالة7. في هذه التجربة، واستنسخ انضغاط الحمض النووي في س. الونجاتوس استخدام الثقافة متزامن مع دورة كل الضوء/الظلام تحت 12 ح، ويتحدد توقيت تجميد العينة الرصد تحت مجهر الأسفار.
النهج الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة الهياكل الحيوية في الخلايا البكتيرية والعزل الصبغي وانقسام الخلية مثل العدوى بالعاثية، وتنطوي على إمكانيات لفتح آفاقاً جديدة في مجال البحوث الميكروبيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قدمنا سلسلة بروتوكولات لتصور عابر انضغاط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء. المفهوم الأساسي مماثلة لتلك التي ستتحقق من الضوء والمجهر الإلكتروني (كليم)12. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا الأسلوب، البكتيريا الحية كانت تخضع للفحص المجهري الأسفار والمجمدة سريعاً على شبكات م وتصور مباشرة مع التصوير المقطعي الإلكترون cryo عالية الجهد. تم بنجاح تصور كتطبيق أول، بنية الحمض النووي تفصيلاً ضغط الخلايا البكتيرية في 3D. حاليا، يتم هذا الإجراء الخاصة بهذا الموضوع، ولكن سيتم تطبيقه على نطاق أوسع، مع منهجية معدلة في بعض الحالات. وتناقش هنا، المزايا والحدود، والاحتمالات المستقبلية لهذا الأسلوب.
ومن مزايا هذا الأسلوب هو التصور 3D من الخلية كلها. 1 MV هفيم بنجاح تصور الدينامية ضغط بنية العضيات سوبسيلولار في الحمض النووي الخلايا. ومع ذلك، يمكن تمييزها هيكل غرامة داخل الخلايا الطبيعية لا بسبب تباين الصورة منخفضة. زيادة مرونة ونثر متعددة في العينات سميكة يطمس الصورة13. صورة صفر-الخسارة ومعظم-المحتمل-خسارة تصفية بواسطة عامل تصفية الطاقة يمكن تحسين تباين الصورة بالحد من تشتت مرن14،15، ولكن فإنه لن يعمل لعينات أكثر سمكا من إيمفب. قمم الخسارة صفر ومعظم-المحتمل-خسارة الانخفاض جذريا مع سمك العينة. أنها صعبة للغاية للحصول على نسبة الإشارة إلى الضوضاء كافية للعينات جزءا لا يتجزأ من الجليد الحساسة إلكترون. موراتا et al. وقد أظهرت أن انتقال المسح 1MV مجهرية (الجذعية) يعطي أعلى تباين الصورة من صورة مشرقة ميدانية في البلاستيك جزءا لا يتجزأ من خلايا الخميرة مع 5 ميكرون سمك، حيث يتم إعطاء الصورة تباين أساسا على النقيض من السعة13 . ومع ذلك، فمن المتوقع أن يخلق تأثير الأضرار كنوكون على الإلكترونات المعجلة أعلى قيد آخر على جرعة الإشعاع لحساسة لأضرار البرد-عينات16. قد يكون تطبيق فولتا وزيرنيكه المرحلة لوحات17،18 بالنسبة هفيم قادرة على الحد من الأضرار كنوكون بتخفيض الجرعة الكلية في المستقبل. قيد آخر على استخدام هفيم للعينات سميكة يأتي من حقيقة أن التسهيلات المستخدم التي توفر هفيم شحيحة في جميع أنحاء العالم.
استخدام منهجية بديلة لمراقبة سميكة العينات، التصوير المقطعي الجذعية البرد في 300 كيلوفولت أثبتت الصور عالية التباين على العينات المجمدة-رطب مع سماكة تزيد عن عدة مئات نانومتر19. لاسترداد مرحلة التباين في البرد-الجذعية، الميكروسكوب الإلكتروني بثيتشوجرافيك كما أدخلت، الذي ينقل لوحة المرحلة في عدسة المكثف حيود التضمين المرحلة إلى كاشف 2D منقطة20. يتم استرداد الصور بواسطة حساب من إنكسار متعددة. يتم تطبيق مباشر وسريع 3D cryo-التصوير من الأم كبيرة تجميد عينات، cryo-التعزيز-وزارة شؤون المرأة يمكن أيضا أن تستخدم21، حيث المسلسل تمزيقها مع شعاع أيون مركزة ومنع تصوير الوجه لتصوير كامل رطب العينات المجمدة. على الرغم من أن هذه التكنولوجيات توسيع نطاق عرض العينات البيولوجية، من الصعب العثور على الموقع المستهدف من البكتيريا، مثل المسمى البكتيريا، لأن الهدف هو تماما تحت الجليد ولا يمكن تحديده قبل اقتطاع.
انضغاط الحمض النووي تنتج بنية متميزة في البكتيريا الزرقاء. الحمض النووي ضغط الخلايا بسهولة الموقر حتى بدون يجري الملون بسبب تحيز كثافة كبيرة داخل الخلايا غير موجودة في الخلايا الطبيعية. ومع ذلك، من أجل تصور المزيد من الأحداث المحلية داخل الخلية، من الضروري نقل المسمى فلوريسسينتلي دوروا في المجهر الإلكتروني. ستتحقق من الضوء والمجهر الإلكتروني (كليم)، صور المجهر الخفيفة وصور المجهر الإلكتروني عموما ترتبط باستخدام الخرز مطاط الفلورسنت أو نقاط الكم على م الباحث عن شبكات12. يجب أن تكون الجسيمات التوسيم للإلكترون عالية الكثافة بالإضافة إلى الأسفار. أنها دقة وموثوقية ربط المواقف بين اثنين من الصور. وعلاوة على ذلك، بالتأكيد على المنطقة المسماة بالبرد الخفيفة الميكروسكوب، يمكن أن يتحقق التداخل الكامل من العائد على الاستثمار بين المجاهر اثنين. عند وصف أحداث هيكلية أكثر تفصيلاً في الضغط الحمض النووي، ستكون هذه الجسيمات ومجهر الضوء cryo أداة لا غنى عنها لعلاقة أكثر قوة وأكثر دقة في المستقبل.
يوضح هذا المقال كيفية تحديد هيكل عابر للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالجمع بين الثقافة متزامن والفحص المجهري الأسفار والتصوير المقطعي الإلكترون البرد الجهد العالي. ويركز هذا البروتوكول على مراقبة الحمض النووي المضغوطة. عن طريق الجمع بين هذا الأسلوب مع غيرها من التكنولوجيات الجديدة المشار إليها أعلاه، فإنه سيكون من الممكن للتحقيق في عملية الضغط الحمض النووي بمزيد من التفصيل، وأساليب تعديلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع للأحداث الهيكلية الأخرى الحيوية في البكتيريا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون التمو ريسيويتز لقراءة نقدية مخطوطة، وسواء “هاياشي ماكو” وهاجيوارا سايوري لزراعة حذراً والمراقبة للبكتيريا الزرقاء ويوشيتاكا كيموري لمعالجة الصور والأغنية كونج، ناويوكي ميازاكي وميوكو ناغايوشي لمساعدة مع تجزئة الهياكل. هذا العمل كان يدعمها “برنامج دراسة تعاونية” للمعهد الوطني فسيولوجية العلوم (خطط التنفيذ الوطنية) إلى مجموعة
Materials
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
| Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
| Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
| Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
| Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
| Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
| Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
| Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
| Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
| Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
| EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
| Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
| Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
| TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
| Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
| BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
| Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
| Electron films | Kodak | SO-163 | |
| Developer | Kodak | D19 | |
| Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
| Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
| Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
| Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
| High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
| Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
| plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
| Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
| Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
| Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
| flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
| Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
| Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |
References
- Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).
- Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
- Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16 (1), 258-263 (2014).
- Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934 (2016).
- Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).
- Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176 (2017).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
- Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
- Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
- Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson, ., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).
- Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
- Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
- Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).
- Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18 (8), 903-912 (2010).
- Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
- Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
