이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.
이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. DNA 압축 최근 일부 남조류 세포 분열의 앞에 발견 하는 극적인 세포질 이벤트입니다. 그러나, 큰 셀 크기와 과도 문자, 그것은 자세히 구조 조사 어렵다입니다. 어려움을 극복 하기 위해 먼저, DNA 압축 reproducibly에서 생산 됩니다 cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 각 명암 주기 12 h를 사용 하 여 동기 문화. 둘째, DNA 압축 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링 이며 급속 동결에 의해 점령. 셋째, DNA의 상세한 구조 압축 셀 고전압 cryo 전자 단층 촬영 하 여 3 차원 (3D)에 시각 이다. 방법의이 세트는 박테리아, 예를들면 세포 분열, 염색체 분리, 살 균 소 감염 등에서 일시적인 구조 조사를 광범위 하 게 적용., 형광 현미경 검사 법에서 모니터링 하 고 직접에 의해 시각 적절 한 시간 점에서 cryo 전자 tomography
DNA 압축 일부 박테리아에서 확인 된 극적인 세포질 이벤트입니다. 때 Synechococcus elongatus 는 교양 12 h 아래 각 명암 주기, 압축 된 다른 시간에 그것의 외관에서 명확 하 게 다른 빛 기간의 끝에 등장 하는 DNA1포인트. 그것은 제안 되었습니다이 프로세스 카이 단백질2에 따라 circadian 시계에 의해 제어 됩니다. 세 키 외 DNA Hoechst 33342 물 빛 기간의 끝으로 S. elongatus 세포에 압축 되었고 형광 현미경 물결 막대 모양을 보여주었다 보고 했다. 다음 압축된 DNA 셀 분할 그리고 마지막으로3각 딸 세포는 정상적인 균일 한 분포에 반환으로 막대의 센터에서 두 가지로 구분. 그러나, 일시적인 자연과 전자 현미경 검사 법에 대 한 큰 크기 구조 분석을 방해. 무라 타 외. 동기 문화, 형광 현미경 검사 법, 급속 동결, 및 높은 포함 여러 방법을 결합 전압 전자 cryo-단층 촬영 (cryo-HVET), 그리고 일시적인 DNA 압축의 구조 확인에 성공 polyphosphate 시체 (PPBs)4의 활동을 포함 하 여. 원고 실험 절차를 결합 하 여 자세히 이러한 어려운 자료의 시각적 설명을 제공 합니다.
S. elongatus 는 캡슐 모양, 길이 2 ~ 5 µ m, 너비 0.5 µ m에 대 한 완벽 한 DNA 압축의 아주 짧은 시간 동안만 생활 셀에 나타납니다. 따라서, cyanobacterial DNA 압축에서 발생 하는 구조적인 변화 자세히 알려지지 않은 됐다. 전자 현미경 검사 법에 의해 이러한 구조를 조사 하기 위하여 그것은 두 가지 주요 기술적 문제를 극복 하는 데 필요한입니다. 하나는 기본 조건, 근처에 전체 박테리아 같은 두꺼운 표본 관찰 이며 다른 동적 구조의 급속 한 고정. 첫 번째 문제에 관해서는 전자의 탄성이 평균 자유 경로 (iMFP) 전자 현미경5의 가속 전압에 따라 달라 집니다. 전송 전자 현미경 (TEM) 300에서 kV, 그것은 보다 350 nm. 예를 들어, 얼음 포함 cyanobacterium (견본 간격 ≈ 600 nm)는 200kV TEM에서 관찰 (iMFP ≈ 250 nm), 셀 내부 구조는 관찰 하기 어려운. 1 MV 가장 대조적 (iMFP ≈ 500 nm) 줄 수 있고 이미지 셀 (그림 1)에 걸쳐 세포질 구조. 솔루션 1의 가속 전압에 고전압 전자 현미경 (HVEM)의 한 부분으로,이 프로토콜에 MV 고용 했다. 그러나, 시설 HVEM을 구현 하는 세계적으로 제한 됩니다. 가능한 대체 솔루션을 또한 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 두 번째 문제는 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)에 의해 해결 되었다. 이 기본 조건, 표본을 급속 냉동 장치를 사용 하 여 액체 탄에 급속 하 게 얼 고 냉동된 순간 수정6의 최소와 함께 직접 관찰은 근처에 동적 구조를 시각화를 위한 강력한 도구입니다. 단층 촬영을 결합, 3 차원 (3D) 구조의 스냅숏으로 기울기 시리즈7에서 개축 될 수 있다. 이 실험에서 DNA 압축 S. elongatus 미만 12 h 각 명암 주기, 동기 문화를 사용 하 여 재현 했다 그리고는 시료의 동결의 타이밍 형광 현미경 모니터링에 의해 결정 되었다.
여기에 설명 된 방법 세균성 세포, 예를 들어 세포 분열, 염색체 분리 및 살 균 소 감염에 동적 구조 연구에 광범위 하 게 적용 되며 미생물 연구에 새로운 길을 열 가능성이 있다.
우리는 박테리아에 과도 DNA 압축을 시각화에 대 한 프로토콜의 순서를 제시 했습니다. 기본 개념은 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)12의 비슷합니다. 또한,이 방법에서는, 살아있는 박테리아 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링, EM 격자에 급속 하 게 동결 되었고 직접 높은 전압 cryo 전자 단층 촬영으로 시각. 첫 번째 응용 프로그램, DNA의 상세한 구조 압축 세균 세포로 성공적으로 3d에서 시각화 했다. 현재,이 절차는이 주제에, 하지만 경우에 따라 수정 된 방법론으로 더 광범위 하 게 적용 됩니다. 여기, 장점, 한계, 그리고이 방법의 미래 가능성 설명 되어 있습니다.
이 방법의 장점 중 하나는 전체 셀의 3 차원 시각화 이다. 1 MV HVEM 성공적으로 동적 시각 subcellular 세포에서 DNA의 구조 압축 셀. 그러나, 정상 세포 내부의 미세 구조 때문에 낮은 이미지 대비 구분할 수 없습니다. 탄력 증가 및 두꺼운 표본에서 여러 분산13이미지 흐리게 합니다. 에너지 필터에 의해 필터링 하는 0-대부분 추정 손실 및 이미지는 inelastic 산란14,15, 줄여 이미지 대비를 향상 시킬 수 있습니다 하지만 iMFP 보다 두꺼운 표본에 대 한 작동 하지 않습니다. 0-가장 가능성이 손실 및 봉우리 견본 두께 대폭 감소. 그것은 특히 전자 민감한 얼음 포함 된 표본에 대 한 충분 한 신호 대 잡음 비율을 얻기 어렵다입니다. 무라 타 외. 나타났습니다 그 1MV 스캐닝 전송 플라스틱에서 밝은 필드 이미지 보다 높은 이미지 대비 5 µ m 두께, 효 모 세포를 포함 하는 현미경 (줄기) 제공 이미지 대비 진폭 대비13에 의해 주어진 주로 . 그러나, 높은 가속된 전자에 효과 연쇄 피해의 또 다른 한계 손상에 민감한 곳을 알아내는-표본16에 대 한 방사선 조사 복용량을 만듭니다 예상 된다. HVEM 볼타 Zernike 단계 격판덮개17,18 의 적용은 미래에 총 복용량을 줄여 연쇄 피해를 줄이기 위해 수 있습니다. HVEM 두꺼운 표본에 대 한 사용 하 여 또 다른 한계는 사용자 시설 HVEM을 제공 하는 세계적으로 부족 한는 사실에서 온다.
두꺼운 표본, 300 곳을 알아내는-줄기 단층을 관찰 하는 다른 방법론을 사용 하 여 kV 몇 백 나노미터19이상의 두께와 냉동 화 표본에 높은 콘트라스트 이미지를 설명 했다. 곳을 알아내는-줄기에 단계 대조를 검색 하려면 전자 pthychographic 현미경 검사 법 또한 도입 되었습니다, 있는 단계 접시 콘덴서 렌즈에 transposes pixelated 2D 탐지기20위상 변조 회절. 이미지는 여러 diffractions에서 계산에 의해 검색 됩니다. 큰 기본 냉동 샘플, cryo-거짓말-SEM의 직접적이 고 빠른 3D cryo 이미징 또한 사용된21, 어디에 집중 된 이온 빔을 단면 직렬 고 수 얼굴 이미지 차단에 대 한 이미징 완전히 수 화 냉동된 표본에 적용 됩니다. 비록 이러한 기술은 생물 표본 보기 범위를 확장, 박테리아의 대상 위치를 찾을 수 어렵습니다 예: 대상과 완전히 얼음은 자르기 전에 확인할 수 수 없습니다 때문에 박테리아를 표시.
DNA 압축 박테리아에 고유한 구조를 생성합니다. DNA는 세포를 압축 때문에 정상 세포에 존재 하지 않는 셀 내에서 큰 밀도 바이어스 얼룩이 되 고 없이 쉽게 구별 됩니다. 그러나, 세포 내의 더 많은 지역 이벤트를 시각화 하기 위해 그것은 전자 현미경에 붙일 레이블된 ROI를 전송 하는 데 필요한. 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)에 대 한 가벼운 현미경 이미지와 전자 현미경 이미지는 일반적으로 상관 EM 파인더 격자12형광 라텍스 구슬 또는 양자 도트를 사용 하 여. 라벨 입자 형광 뿐만 아니라 높은 전자 밀도의 해야 합니다. 그들은 수 있는 정확 하 고 안정적으로 상관 두 이미지 사이의 위치. 또한, cryo-가벼운 현미경 검사 법으로 레이블이 지정 된 영역을 확인 하 여 두 현미경 사이 완전 한 중복 투자 수익의를 얻을 수 있습니다. 더 자세한 구조 이벤트 DNA 압축 특성화 때이 입자 및 곳을 알아내는-가벼운 현미경 보다 강력 하 고 정확한 상관 관계를 미래에 대 한 필수적인 도구 있을 것입니다.
이 문서에서는 동기 문화, 형광 현미경 검사 법 및 높은 전압 cryo 전자 단층 촬영의 조합에 의해 박테리아의 DNA 압축의 일시적인 구조를 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 압축 된 DNA의 관찰에 중점을 둡니다. 위에서 언급 한 다른 새로운 기술로이 메서드를 결합 하 여 더 자세히, DNA 압축 하는 과정을 조사할 수 있을 것입니다 하 고 적절 한 수정된 방법을 널리 박테리아에서 다른 동적 구조 이벤트에 적용 되는.
The authors have nothing to disclose.
저자는 원고, 고 마 코 하 야 시와의 사유리 하기와 라 주의 재배에 대 한 중요 한 독서와 남조류, 요시타카 Kimori 이미지 처리를 위해, Chihong 노래, 미야자키 나 오 유키, 그리고 님의 Tammo Reisewitz 감사 나가요시는 구조의 세분화와 도움에 대 한입니다. 이 작품 국립 연구소의 공동 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생리 적인 과학 (일본군)에 영 규 과장
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |