该协议描述了如何可视化蓝藻中的瞬态 DNA 压缩。采用同步培养、荧光显微镜、快速冷冻、高压低温电子层析成像等技术进行监测。提出了这些方法的一个协议, 并讨论了未来的应用和发展。
该协议描述了如何可视化蓝藻中的瞬态 DNA 压缩。DNA 压实是最近发现的一个戏剧性的细胞质事件发生在一些蓝藻细胞分裂之前。然而, 由于细胞大小和瞬态特性的存在, 很难对结构进行详细的研究。为了克服这些困难, 首先, 蓝藻细长细长PCC 7942 中的 DNA 压实是通过同步培养, 每光/暗循环的12小时重现性产生的。其次, 用荧光显微镜对 DNA 压实进行监测, 快速冷冻捕获。第三, 采用高压低温电子层析成像技术, 在三维 (3D) 中可视化了 DNA 压缩细胞的详细结构。这套方法广泛适用于研究细菌中的瞬态结构,如细胞分裂、染色体分离、噬菌体感染等, 通过荧光显微镜观察, 直接可视化低温电子层析成像在适当的时间点。
DNA 压实是在一些蓝藻中发现的一种戏剧性的细胞质事件。当细长细长在每光/暗循环下培养12小时时, DNA 在光周期结束时就会凝结, 而在其他时间点1则明显不同于它的外观。有人建议, 这个过程是由一个昼夜节律时钟的基础上的凯蛋白2。Seki等人报告说, 赫斯特33342的 DNA 被压实在S. 细长细胞向光周期结束, 并在荧光显微镜下显示波浪状的杆形。被压缩的脱氧核糖核酸然后分离成二在杆的中心作为细胞划分, 并且最后回到正常均匀分布在每个女儿细胞3。然而, 它的瞬态性质和大尺寸的电子显微镜阻碍了结构分析。村田等结合多种方法, 包括同步培养、荧光显微、快速冷冻、高压电子低温层析 (HVET), 成功地确定了瞬态 DNA 压实的结构,包括聚磷酸盐体的动力学 (PPBs)4。该手稿通过结合实验程序, 对这种困难的材料进行了详细的视觉解释。
细长有一个蒴果形状, 长度为2到5µm, 宽度约为0.5 µm, 而完美的 DNA 压实在活细胞中只在很短的时间内出现。因此, 蓝藻 DNA 压实中发生的结构变化是未知的。为了通过电子显微镜对这些结构进行研究, 有必要克服两个主要的技术问题。一种是在接近当地条件下观察到整个细菌的厚标本, 另一种是动态结构的快速固定。对于第一个问题, 电子显微镜5的加速电压依赖于 iMFP 的非弹性平均自由路径。在透射电镜 (TEM) 的300伏, 它是小于 350 nm。例如, 当在 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm) 中观察到冰嵌入的蓝藻 (试样厚度≈ 600 nm) 时, 细胞内的结构很难观察。相比之下, 1 MV (iMFP ≈ 500 nm) 可以给和图像的细胞质结构在整个细胞 (图 1)。在本协议中, 作为解决方案的一部分, 采用了 1 MV 加速电压的高压电子显微镜 (高压电能表)。然而, 实施高压电能表的设施在世界范围内受到限制。讨论部分还讨论了可能的替代解决方案。第二个问题是通过低温电子显微镜 (冷冻 EM) 来解决的。这是一个强大的工具, 以可视化的动态结构在接近当地条件, 其中标本是迅速冻结在液态乙烷使用快速冻结装置, 和冻结的时刻是直接观察到最小的修改6。结合层析成像, 三维 (3D) 结构的快照可以从倾斜系列7重建。在本实验中, DNA 压实是在S. 细长中用同步培养法在每光/暗循环下复制的, 并通过荧光显微镜下的监测确定标本的凝固时间。
本文介绍的方法广泛适用于细菌细胞的动态结构研究,如细胞分裂、染色体分离和噬菌体感染, 并有可能开辟微生物研究的新途径。
我们提出了一系列的协议, 以可视化的瞬态 DNA 压缩在蓝藻。基本概念类似于相关光和电镜 (克莱)12。此外, 在该方法中, 用荧光显微镜对活蓝藻进行监测, 在 EM 网格上快速冻结, 并直接通过高压低温电子层析成像进行可视化。作为第一个应用, DNA 压缩细菌细胞的详细结构在3D 成功地被形象化。目前, 这一程序是专门针对这个问题的, 但它将得到更广泛的应用, 并在某些情况下采用改进的方法。在此, 讨论了该方法的优点、局限性和未来的可能性。
该方法的优点之一是整个细胞的3D 可视化。1 MV 高压电能表成功地对 DNA 压实细胞中亚细胞细胞器的动态结构进行了可视化。然而, 由于图像对比度低, 正常细胞内的精细结构无法区分。在厚试样中增加非弹性和多重散射, 模糊了图像13。通过能量过滤器进行零损耗和最可能损耗图像滤波, 可以减少非弹性散射14、15, 从而提高图像对比度, 但对比 iMFP 厚的试样不起作用。随着试样厚度的增加, 零损耗和最可能损失峰值急剧减小。对于电子敏感的冰嵌入试样来说, 获得足够的信噪比是特别困难的。村田等已经表明, 1MV 扫描透射显微镜 (茎) 比一个明亮的场图像, 在5µm 厚度的塑料嵌入酵母细胞的图像对比, 其中图像对比主要由振幅对比13.然而, 预计撞击损伤对高加速电子的影响对损伤敏感的低温试样的辐照剂量产生了另一个限制16。应用 Zernike 相板17,18为高压电能表可能能够减少撞击伤害通过减少总剂量的未来。对厚样本使用高压电能表的另一个限制是, 提供高压电能表的用户设施在全球范围内是稀缺的。
使用另一种方法来观察厚的标本, 300 kV 的低温干细胞断层扫描显示了高对比度图像的冷冻水合试样的厚度超过了百纳米19。为了检索低温茎中的相对比度, 还介绍了电子 pthychographic 显微术, 其中在冷凝器透镜中的相板对调一个失真2D 探测器20的相位调制衍射。通过多个衍射的计算来检索图像。对于大型本机冷冻样品的直接快速3D 冷冻成像, 也可以使用低温-SEM-扫描电镜21, 用聚焦离子束和块面成像进行序列切片, 用于成像全水合冰冻标本。尽管这些技术扩大了生物标本的观赏范围, 但很难找到细菌的目标位置,例如标记细菌, 因为目标完全在冰下, 在修剪前无法辨认。
DNA 压实在蓝藻中产生明显的结构。DNA 压实细胞很容易分辨, 即使不被染色, 因为在细胞中不存在于正常细胞内的大密度偏倚。然而, 为了使细胞内更多的局部事件可视化, 有必要将荧光标记的 ROI 转移到电子显微镜中。对于相关的光和电子显微学 (克莱), 光镜图像和电子显微镜图像通常是相关的使用荧光乳胶珠或量子点在 EM 搜索网格12。除荧光外, 标签颗粒必须具有高的电子密度。它们可以准确和可靠地关联两个图像之间的位置。此外, 通过用低温显微镜确认标记区域, 两个显微镜之间可以实现 ROI 的完全重叠。在描述 DNA 压实的更详细的结构事件时, 这些粒子和低温光显微镜将成为未来更加强健和准确的相关性的不可缺少的工具。
本文通过同步培养、荧光显微镜和高压低温电子层析成像的结合, 说明了蓝藻 DNA 压实的瞬态结构特征。本协议的重点是对压实 DNA 的观察。将该方法与上述其他新技术相结合, 可以进一步深入研究 DNA 压实过程, 并对细菌中其他动态结构事件进行适当的改进。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢塔莫 Reisewitz 对手稿的批判性阅读, 以及对蓝鲨林和小百合萩的精心栽培和观察蓝藻, 吉孝城守的图像处理, 驰宏歌曲, Naoyuki 宫崎, 美代子Nagayoshi 帮助分割结构。这项工作得到了国家生理学科学研究所 (NIPS) 合作研究计划的支持, 张佑启
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |