Этот протокол описывает, как визуализировать переходных уплотнения ДНК в синезеленых водорослей. Синхронные культивирования, мониторинг микроскопии флуоресцирования, быстрое замораживание и высокого напряжения крио электронная томография используются. Представил протокол для этих методик, и будущие приложения и события обсуждаются.
Этот протокол описывает, как визуализировать переходных уплотнения ДНК в синезеленых водорослей. ДНК уплотнения является событием драматического цитоплазмы, недавно обнаружили в некоторых цианобактерий до деления клеток. Однако из-за большой размер и переходный характер, трудно исследовать структуру в деталях. Чтобы преодолеть трудности, во-первых, ДНК уплотнения можно воспроизвести производится в цианобактерии Synechococcus удлинённый PCC 7942 синхронных культуры с использованием 12 h каждого цикла свет/темно. Во-вторых ДНК Сжатие контролируется микроскопии флуоресцирования и захвачен быстрое замораживание. В-третьих, подробная структура ДНК уплотненных клетки визуализируется в трех измерениях (3D), крио электронная томография высокого напряжения. Этот набор методов широко применяется для изучения временных структур в бактерии, например деление клеток, хромосома сегрегации, фаг инфекции и т.д., которые контролируются микроскопии флуоресцирования и непосредственно визуализированное крио электронная томография в соответствующее время точках.
ДНК уплотнения является драматического цитоплазматических событие, которое определило в некоторых цианобактерий. Когда Synechococcus удлинённый был культивированный под 12 h каждого цикла свет/темно, ДНК, конденсированной появилась в конце периода света, который был явно отличается от его внешний вид, в то время очка1. Было высказано предположение о том, что этот процесс контролируется суточного часов, основанный на Кай белки2. Секи et al. сообщили что ДНК, окрашенных с Hoechst 33342 уплотняется в S. удлинённый клетки к концу периода света и показал волнистые стержня форму под флуоресцентным микроскопом. Уплотненный ДНК затем разделены на две в центре стержня как ячейки разделены и наконец вернулся в нормальное равномерное распределение в каждой ячейке дочь3. Однако его временный характер и большого размера для электронной микроскопии препятствия структурного анализа. Murata et al. в сочетании нескольких методов, включая синхронных культуры, микроскопии флуоресцирования, быстрое замораживание и высокого напряжения электрон крио томография (крио HVET) и удалось в определении структуры переходных ДНК уплотнения, включая кинетику полифосфат органов (ППБ)4. Рукопись обеспечивает визуальное объяснение такой сложный материал в деталях, объединяя экспериментальных процедур.
S. удлинённый имеет форму капсул, длиной 2-5 мкм, шириной о 0,5 мкм и идеальный ДНК уплотнения появляется в живых клетках только на очень короткое время. Таким образом структурные изменения, происходящие в цианобактерий уплотнения ДНК были неизвестны в деталях. Для того, чтобы расследовать эти структуры электронной микроскопии, необходимо преодолеть две основные технические проблемы. Одно наблюдение за такой толстый образца всего бактерии в вблизи собственных условий, и другой быстрой фиксации динамической структурой. Что касается первой проблемы неупругого означает свободный путь (iMFP) электронов зависит от ускоряющего напряжения микроскопа5. В просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА) 300 кв, это менее чем 350 Нм. Например, когда лед встроенный цианобактерии (толщина образца ≈ 600 Нм) наблюдается в 200kV ТЕА (iMFP ≈ 250 Нм), структуры внутри ячейки трудно соблюдать. С другой стороны, 1 MV ТЕА (iMFP ≈ 500 Нм) может дать и изображения цитоплазматических структуры всей клетки (рис. 1). В этом протоколе, как часть решения, электронный микроскоп высокого напряжения (HVEM) на ускоряющего напряжения 1 MV было занято. Однако услуги, реализующих HVEM ограничены во всем мире. Возможные альтернативные решения, также обсуждаются в разделе обсуждения. Вторая проблема была решена путем крио электронная микроскопия (крио EM). Это мощный инструмент для визуализации динамических структур на вблизи родной условий, где быстро образец замораживается в жидкий Этан, используя устройство быстрого замораживания, и замороженные момент наблюдается непосредственно с минимальными изменениями6. Сочетание с томография, снимок трехмерной (3D) структуры могут быть реконструированы из серии наклона7. В этом эксперименте уплотнения ДНК был воспроизведен в S. удлинённый с использованием синхронных культуры под 12 h каждый свет/темно цикла и времени замораживания образца определяется мониторинга под флуоресцентным микроскопом.
Подходы, описанные здесь широко применяются для изучения динамических структур клетки бактерий, например деление клеток, хромосома сегрегации и ФАГ инфекции и имеют потенциал, чтобы открыть новые возможности в микробиологических исследованиях.
Мы представили последовательность протоколов для визуализации переходных ДНК уплотнения в синезеленых водорослей. Основная концепция аналогична коррелятивных света и электронной микроскопии (Клем)12. Кроме того в этом методе, живой цианобактерий были под наблюдением микроскопии флуоресцирования, быстро заморожены на ет сетки и непосредственно визуализированы с крио электронная томография высокого напряжения. Как первое приложение, подробная структура ДНК уплотненных бактериальной клетки успешно был визуализирован в 3D. В настоящее время эта процедура относится только к этому вопросу, но он будет применяться более широко, с изменение методологии в некоторых случаях. Здесь обсуждаются преимущества, недостатки и будущие возможности этого метода.
Одним из преимуществ данного метода является 3D визуализация всей ячейки. 1 MV HVEM успешно визуализирована динамического сжатия структура внутриклеточных органелл в ДНК клетки. Однако тонкой структуры внутри нормальные клетки не могут различаться из-за низкой контрастности. Увеличение неупругого и многократного рассеяния в толстых образцах размывает изображение13. Нулевых потерь и большинство вероятная потери изображений, фильтрация фильтром энергии может улучшить контрастность изображения путем сокращения глубоконеупругого рассеяния14,15, но он не будет работать для образцов толще, чем iMFP. Вершины нулевых потерь и большинство вероятная потеря резко уменьшается с толщины образца. Это особенно трудно получить достаточно соотношение сигнал шум для чувствительных льда встроенный образцов электрона. Murata et al. показали, что 1 МВ сканирования передачи микроскопии (STEM) дает высокий контраст изображения чем светлые области изображения в пластик встроенный дрожжевых клеток толщиной 5 мкм, где контраст изображения определяется главным образом амплитуда контраст13 . Однако как ожидается, что эффект домино ущерба на более ускоренных электронов создает еще одно ограничение для дозы облучения для повреждения чувствительных крио образцы16. Приложение Вольта и Цернике фазы пластины17,18 для HVEM может иметь возможность уменьшить повреждения домино, уменьшая общая доза в будущем. Еще одно ограничение использования HVEM для толстых образцов происходит из того факта, что пользователь услуги, которые предоставляют HVEM ограничены во всем мире.
Использование альтернативной методологии для наблюдения за толщиной образцов, крио стволовых томография на 300 кв продемонстрировал высокий контраст изображения на замороженные гидратированных образцов с толщиной свыше нескольких сотен нанометров19. Чтобы получить фазового контраста в крио СТЕБЕЛЬ, pthychographic микроскопии также введена, в котором фазы пластины в объектив конденсатора транспонирует фаза модулированных дифракции чтобы неровной 2D детектор20. Изображения получаются путем расчета от нескольких дифракций. Для прямой и быстрый 3D крио изображений больших родной замороженных образцов, крио БМУ-SEM может также быть используется21, где серийный секционирование с целенаправленной ионного пучка и блокировать изображений лица применяется для визуализации полностью гидратированных замороженных образцов. Хотя эти технологии расширения спектра просмотра биологических образцов, трудно найти в целевое расположение бактерий, например помечены бактерий, потому что цель полностью под лед и не могут быть идентифицированы перед отделкой.
ДНК сжатие производит четкую структуру в синезеленых водорослей. Уплотненный ДНК клетки легко выделяются даже без витражи из-за большой плотности смещения внутри клетки, которая не присутствует в нормальных клетках. Однако для того, чтобы визуализировать более местные события в ячейке, необходимо перевести в электронный микроскоп дневно обозначенные ROI. Для корреляционного света и электронной микроскопии (Клем) световой микроскоп изображения и изображения микроскопа обычно связаны как с использованием флуоресцентных латексные шарики или квантовых точек на EM finder сетки12. Маркировки частицы должны быть высокой электронной плотности помимо флуоресценции. Они могут точно и достоверно коррелируют позиции между двумя изображениями. Кроме того подтверждая помечены зона с крио свет микроскопии, полное перекрытие ROI может быть достигнуто между двумя микроскопы. При характеристике более подробные структурные события в ДНК уплотнения, эти частицы и Микроскоп крио свет будет незаменимым инструментом для более надежной и точной корреляции в будущем.
Эта статья показывает, как характеризовать переходные структуры ДНК уплотнения в цианобактерий сочетанием синхронных культуры, флуоресцентной микроскопии и крио электронная томография высокого напряжения. Этот протокол сосредоточена на наблюдении за уплотненной ДНК. Объединив этот метод с других новых технологий, упомянутых выше, будет возможность исследовать процесс уплотнения ДНК более подробно, и измененном методы широко применяются для других динамических структурных мероприятий в бактерии.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Tammo Reisewitz для критических чтении рукопись и как Мако Хаяси и Саюри Hagiwara для тщательного выращивания и наблюдения цианобактерий, Yoshitaka Kimori для обработки изображения, Chihong песни, Наоюки Миядзаки и Миёко Нагайоши за помощь с сегментация структур. Эта работа была поддержана совместной программы исследований Национального института для физиологических наук (НПВ) ю.к.
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |