Det här protokollet beskriver hur att visualisera den övergående DNA packningen i cyanobakterier. Synkron odling, övervakning av fluorescensmikroskopi, snabb nedfrysning och hög spänning cryo-elektron tomografi används. Ett protokoll för dessa metoder presenteras och diskuteras framtida tillämpningar och utvecklingen.
Det här protokollet beskriver hur att visualisera den övergående DNA packningen i cyanobakterier. DNA packning är en dramatisk cytoplasmiska händelse nyligen funnit för att inträffa i vissa cyanobakterier innan celldelningen. På grund av den stora cellstorleken och övergående karaktär är det dock svårt att undersöka strukturen i detalj. För att övervinna svårigheterna, först produceras DNA packning reproducibly i Cyanobakterien Synechococcus elongatus PCC 7942 av synkron kultur med 12 h varje ljus/mörk cykel. Andra är DNA packning övervakas av fluorescensmikroskopi och fångas av snabb nedfrysning. Tredje, detaljerad struktur av DNA packas celler visualiseras i tre dimensioner (3D) av högspänning cryo-elektron tomografi. Denna uppsättning metoder är allmänt tillämplig att undersöka övergående strukturer i bakterier, e.g. celldelning, kromosomsegregering, phage infektion osv., som övervakas av fluorescensmikroskopi och visualiseras direkt av Cryo-elektron tomografi vid lämpliga tidpunkter.
DNA packning är en dramatisk cytoplasmiska händelse som har identifierats i vissa cyanobakterier. När Synechococcus elongatus var odlade under 12 h varje ljus/mörk cykel, DNA syntes sammandrag i slutet av perioden ljus, som var klart avvikande från utseendet på den andra tiden pekar1. Det har föreslagits att denna process styrs av en dygnsrytm klocka baserat på Kai proteiner2. Seki et al. har rapporterat att DNA färgas med Hoechst 33342 var packas i S. elongatus celler mot slutet av perioden ljus och visade en vågig rod-form i fluorescens Mikroskop. Kompakterade DNA separeras sedan i två i mitten av stången som cellen delas, och slutligen återvände till en enhetlig normalfördelningen i varje dotter cell3. Men hämmade dess övergående natur och stor storlek för elektronmikroskopi strukturell analys. Murata et al. kombinerat flera metoder, inklusive synkron kultur, fluorescensmikroskopi, snabb nedfrysning och hög spänning electron cryo-tomografi (cryo-HVET), och lyckades identifiera strukturen av övergående DNA kompaktering, inklusive kineticsen av polyfosfat organ (PPBs)4. Manuskriptet innehåller visuell förklaring av sådant svårt material i detalj genom att kombinera de experimentella rutiner.
S. elongatus har en kapsel form, en längd på 2 till 5 µm, en bredd på om 0,5 µm och perfekt DNA kompaktering visas i levande celler endast för en mycket kort tid. Därför, de strukturella förändringar som sker i den Cyanobakterie DNA-packningen var okända i detalj. För att undersöka dessa strukturer genom elektronmikroskopi, är det nödvändigt att övervinna två tekniska problem. En är observationen av sådana ett tjockt exemplar av hela bakterien på nära infödda villkor, och den andra är snabb fixering av en dynamisk struktur. När det gäller det första problemet beror oelastisk genomsnittlig gratis sökvägen (iMFP) av elektroner på den accelererande spänningen av elektronmikroskop5. I ett transmissionselektronmikroskop (TEM) på 300 kV, det är mindre än 350 nm. Till exempel när en is-embedded Cyanobakterie (preparatet tjocklek ≈ 600 nm) observeras i 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), strukturerna inuti cellen är svåra att observera. Däremot 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) kan ge och bild av cytoplasmisk strukturen i hela cellen (figur 1). I detta protokoll, som en del av lösningen, en hög spänning elektronmikroskop (HVEM) vid en accelererande spänning på 1 MV var anställd. Faciliteter som implementerar HVEM är dock begränsade i världen. Möjliga alternativa lösningar diskuteras också i avsnittet diskussion. Det andra problemet löstes av cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Detta är ett kraftfullt verktyg för att visualisera dynamiska strukturer på nära inhemska förhållanden, där preparatet är snabbt nedfruset i flytande etan använder en snabb frysning enhet, och det frusna ögonblicket observeras direkt med ett minimum av ändringar6. Kombinera med datortomografi, kan en ögonblicksbild av tredimensionella (3D) strukturer rekonstrueras från tilt serie7. I detta experiment, DNA packning reproducerades i S. elongatus använder synkron kultur under 12 h varje ljus/mörk cykel, och tidpunkten för frysning av provet bestämdes av övervakning i fluorescens Mikroskop.
De metoder som beskrivs här är allmänt tillämpliga på studiet av dynamiska strukturer i bakterieceller, e.g. celldelning, kromosomsegregering och phage infektion, och har en potential att öppna nya vägar i mikrobiologisk forskning.
Vi har lagt fram en sekvens av protokoll för att visualisera övergående DNA packning i cyanobakterier. Det grundläggande konceptet är liknande till det av korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM)12. Dessutom i denna metod, var levande cyanobakterier övervakas av fluorescensmikroskopi, snabbt frusen på EM rutnät och direkt visualiseras med högspänning cryo-elektron tomografi. Som en första ansökan, detaljerad struktur av DNA packas bakterieceller var framgångsrikt visualiseras i 3D. För närvarande detta förfarande är specifika för detta ämne, men den kommer att tillämpas mer omfattande, med modifierad metodik i vissa fall. Här diskuteras fördelarna, begränsningarna och de framtida möjligheterna av denna metod.
En av fördelarna med denna metod är 3D-visualisering av hela cellen. 1 MV HVEM framgångsrikt visualiseras dynamiskt struktur av subcellulär organeller i DNA packas celler. I fina struktur inuti normala celler kan dock inte särskiljas på grund av låg bildens kontrast. Ökande oelastisk och flera spridning i tjocka exemplar suddigare bild13. Noll- och de flesta-trolig-förlust bild filtrering av ett energi-filter kan förbättra bildkontrasten genom att minska inelastiska scattering14,15, men det fungerar inte för exemplar som är tjockare än iMFP. Noll- och de flesta-trolig-förlust topparna minskar drastiskt med preparatet tjocklek. Det är särskilt svårt att få en tillräcklig signal-brus-förhållande för elektron känsliga is-embedded exemplar. Murata et al. har visat att 1MV skanning överföring mikroskopi (STEM) ger högre bildens kontrast än en ljusa fältet bild i plast inbäddade jästceller med 5 µm tjocklek, där avbildakontrasten ges primärt av amplitud kontrast13 . Det förväntas dock att effekten av indirekt skada på högre accelererade elektroner skapar en annan begränsning till bestrålning dos för skada känsliga cryo-exemplar16. Tillämpningen av Volta och Zernike fas plattor17,18 för HVEM kan kunna minska knock-on skador genom att minska den totala dosen i framtiden. En annan begränsning att använda HVEM för tjocka exemplar kommer från det faktum att användaren som ger HVEM är knappa över hela världen.
Använda en alternativ metod för att iaktta tjocka exemplar, cryo-stammen tomografi 300 har kV visat hög kontrast bilder på fryst-hydrerad exemplar med tjocklek överstiger flera hundra nanometer19. För att hämta faskontrast cryo-Stem, har pthychographic elektronmikroskopi också införts, där fas plattan i kondensorn linsen införlivar en fas-modulerat diffraktion till en pixelated 2D detektorn20. Bilderna hämtas genom beräkning från flera diffractions. För direkt och snabb 3D cryo-imaging stora Native frysta prover, cryo-FIB-SEM kan också använda21, där seriell sektionering med en fokuserad ion beam och blockera ansikte imaging tillämpas för imaging fullt hydrerad frysta prover. Även om dessa tekniker utöka visning av biologiska prover, det är svårt att hitta platsen för bakterier, t.ex. märkt bakterier, eftersom målet är helt under isen och inte kan identifieras innan trimning.
DNA-komprimering ger en tydlig struktur i cyanobakterier. DNA packas celler är lätt skiljer sig även utan att vara missfärgade på grund av en stor täthet partiskhet i celler som inte är närvarande i normala celler. Att visualisera fler lokala evenemang i cellen, är det dock nödvändigt att överföra fluorescently märkt ROI i elektronmikroskopet. För korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM), är ljusmikroskop och elektronmikroskop bilder generellt korrelerade med fluorescerande latex pärlor eller kvantprickar på EM finder rutnät12. Märkning partiklarna måste vara av hög elektrontätheten förutom fluorescens. De kan exakt och tillförlitligt korrelerar ståndpunkterna mellan de två bilderna. Dessutom kan bekräftar märkta området med kryo-Ljus microscopy, fullständig överlappning av ROI uppnås mellan två Mikroskopen. När kännetecknar mer detaljerade strukturella händelser i DNA kompaktering, blir dessa partiklar och cryo-ljus mikroskopet ett oumbärligt verktyg för en mer robust och exakt korrelation i framtiden.
Denna artikel visar hur att karakterisera DNA packning i cyanobakterier övergående struktur genom en kombination av synkron kultur, fluorescensmikroskopi och högspänning cryo-elektron tomografi. Detta protokoll fokuserar på observation av kompakterade DNA. Genom att kombinera denna metod med annan ny teknik som nämns ovan, det kommer vara möjligt att undersöka processen av DNA compaction mer i detalj och passande modifierade metoder är allmänt tillämpliga på andra dynamiska strukturella händelser i bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Tammo Reisewitz tack för kritisk läsning av manuskript, och både Mako Hayashi och Sayuri Hagiwara för noggrann odling och observation av cyanobakterier, Yoshitaka Kimori för bildbehandling, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki och Miyoko att författarna Nagayoshi för att hjälpa med segmentering av strukturerna. Detta arbete stöds av programmet Collaborative studie av det nationella institutet för fysiologiska vetenskaper (NVP) till Y.K.
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |