Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour quantifier et qualifier chaque espèce de sphingomyéline multiple réaction sous contrôle et le mode MS/MS/MS, respectivement.
Abstract
Nous présentons une méthode d’analyse de sphingomyéline (SM) qualitativement et quantitativement par chromatographie en phase liquide-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (LC-ESI-MS/MS). SM est un SPHINGOLIPIDE commun composé d’une phosphorylcholine et un céramide, appelé le composant hydrophile et hydrophobe, respectivement. Un certain nombre d’espèces de SM est présent dans les cellules de mammifères en raison d’une variété de la SPHINGOÏDES longue chaîne base (LCB) et un N-groupement acyle dans la céramide. Dans ce rapport, nous montrons une méthode d’estimation du nombre de carbone et des doubles liaisons dans une lame et un N-groupement acyle issu de leurs ions correspondants du produit dans les expériences de MS/MS/MS (MS3). En outre, nous présentons une méthode d’analyse quantitative pour SM en utilisant deux stable isotopiquement étiquetés SM espèces, qui facilite la détermination la plage utilisée dans la quantification de la SM. La présente méthode sera utile pour la caractérisation de diverses espèces de SM dans des échantillons biologiques et les produits industriels tels que les cosmétiques.
Introduction
Sphingomyéline (SM) est un SPHINGOLIPIDE commune dans les cellules de mammifères. SM est synthétisée dans les cellules1 et présent comme un précurseur pour les autres sphingolipides comme une sphingosine-1-phosphate et un céramide, qui ont un rôle crucial en immunitaire cellulaire traite et barrière l’homéostasie, respectivement2, de la peau 3. Ainsi, l’analyse précise du métabolisme SM est importante pour élucider les rôles physiologiques et pathologiques des sphingolipides.
SM est composé d’un céramide et une phosphorylcholine qui est liée au groupe hydroxy-1 de la céramide, qui regroupe plus d’une sphingosine et un N-groupement acyle. Une variété du nombre de carbone et la double liaison dans la sphingosine et N-groupement acyle résulte en l’espèce nombre de céramide (et SM). Les progrès récents dans LC-ESI-MS/MS a permis une analyse quantitative et qualitative des SM4,5. Dans l’analyse qualitative, le nombre de carbone et de doubles liaisons d’un SPHINGOÏDES LCB de SM a été identifiés en assignant des spectres ion produit de LCB. Cependant, information structurale de la N-groupement acyle ne provient pas directement car ses ions produit correspondant n’a été signalées et par conséquent N-groupements acyles sont déduites par l’analyse différentielle entre les ions précurseurs et ions produits correspondant à la LCB dans les deux modes d’ions positifs et négatifs4,5. Dans ce rapport, nous présentons une méthode pour détecter les ions produit de LCB et N-groupement acyle simultanément en mode de3 MS à l’aide de triple quadripôle et spectrométrie de masse linéaire piège ionique quadripolaire, qui facilite la construction précise spéculation de chaque espèce de SM6.
Les effets de suppression (ou amélioration) ion causées par la matrice dans des échantillons biologiques entravent la quantification précise dans l’analyse de LC-ESI-MS, et par conséquent, il est souhaitable de construire les courbes d’étalonnage pour tous les analytes d’intérêt dans la matrice identique de l’échantillon biologique. Toutefois, cette stratégie n’est pas possible car il est presque impossible de préparer toutes les espèces de SM dans des échantillons biologiques, en particulier dans l’analyse complète. Ainsi, il est pratique de construire une courbe d’étalonnage et déterminer l’échelle quantitative à l’aide d’une espèce représentative de SM dopée dans les échantillons biologiques. Nous avons utilisé deux espèces de SM isotopiquement étiquetés pour établir une courbe d’étalonnage ; a été utilisé pour un étalon interne et l’autre pour un standard composé. Nous avons détecté une petite quantité d’espèces de SM isotopiquement étiquetés comme un composé standard dopés dans des échantillons biologiques et a réussi à obtenir une courbe d’étalonnage et le quantitatif rang6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la présente méthode qualitative, nous avons obtenu MS3 ions produits un CCP et un N-groupement acyle. Il est essentiel d’affecter correctement un SPC tant un N-groupement acyle. À cette fin, il convient de noter que les autres molécules contenant de phosphorylcholine peuvent également être détectés sous forme d’ions de produit3 MS. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) et plasmalogène-PC sont abondamment présents dans les cellules de mammifères et leur hydrophobicité…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche du ministère de l’Education, Culture, Sports, Science et technologie du Japon (KAKENHI) à K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) et une subvention pour l’étude de morbidité insolubles du ministère de Health, Labour and Welfare (K.Y. #201510032A). Nous remercions le groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour l’édition d’un projet de ce manuscrit.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
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