Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare e qualificare ogni specie di sfingomielina utilizzando Monitoraggio multiplo di reazione e la modalità di MS/MS/MS, rispettivamente.
Abstract
Presentiamo un metodo di analisi di sfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente di liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). SM è un comuni sfingolipidi formato da un fosforilcolina e una ceramide come le componenti idrofile e idrofobe, rispettivamente. Un numero di specie di SM è presente in cellule di mammiferi a causa di una varietà della sfingoide lunga catena base (LCB) e un N-frazione di acil nella ceramide. In questo rapporto, indichiamo un metodo per stimare il numero di carbonio e legami doppi in un LCB e un N-frazione di acil basato su loro corrispondenti ioni prodotto negli esperimenti di MS/MS/MS (MS3). Inoltre, presentiamo un metodo di analisi quantitativa per SM usando due isotopicamente etichettato SM specie stabili, che facilita la determinazione l’intervallo utilizzato nella quantificazione di SM. Il presente metodo sarà utile nella caratterizzazione di una varietà di specie di SM in campioni biologici e prodotti industriali come cosmetici.
Introduction
Sfingomielina (SM) è un comuni sfingolipidi in cellule di mammifero. SM è sintetizzato intracellulare1 e presente come precursore per altri sfingolipidi come un sfingosina-1-fosfato e una ceramide, che hanno un ruolo cruciale nella immunitario cellulare traffico e omeostasi della barriera, rispettivamente2, la pelle 3. Pertanto, l’analisi precisa del metabolismo SM è importante per chiarire i ruoli fisiologici e patologici degli sfingolipidi.
SM è composto di una ceramide e un fosforilcolina che è collegato al 1-idrossi gruppo di ceramide, che ulteriormente si compone di un sfingosina e un N-frazione di acil. Una varietà nei numeri carbonio e doppio legame nella sfingosina e N-frazione di acil risultati nelle specie numero di ceramide (e SM). Gli avanzamenti recenti nella LC-ESI-MS/MS ha permesso un’analisi quantitativa e qualitativa di SM4,5. Nell’analisi qualitativa, il numero di carbonio e doppi legami di un sfingoide LCB di SM è stati identificati tramite l’assegnazione di spettri di ioni prodotto di LCB. Tuttavia, informazioni strutturali della N-frazione di acil non è stata ottenuta direttamente perché non sono stati segnalati relativi ioni prodotto corrispondente e quindi N-moiety acil sono state dedotte da analisi differenziale tra ioni precursori e ioni di prodotto corrispondente a LCB in entrambi ioni positivi e negativi modalità4,5. In questo rapporto, presentiamo un metodo per rilevare gli ioni prodotto di LCB e di N-frazione di acil simultaneamente in modalità di3 MS utilizzando triplo quadrupolo e spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica, che facilita la precisa strutturale speculazioni di ogni specie di SM6.
Gli effetti di soppressione (o aumento) di ioni causati dalla matrice in campioni biologici ostacolano la quantificazione accurata in analisi LC-ESI-MS e pertanto, è auspicabile per costruire curve di calibrazione per tutti gli analiti di interesse nella matrice identica del campione biologico. Tuttavia, questa strategia non è fattibile perché è quasi impossibile preparare tutte le specie di SM nei campioni biologici, soprattutto in un’analisi completa. Così, è pratico costruire una curva di taratura e determinare l’intervallo quantitativa mediante una specie rappresentativa di SM a spillo nei campioni biologici. Abbiamo usato due specie di SM isotopicamente etichettato per costruire una curva di taratura; uno è stato usato per uno standard interno e l’altro per uno standard composto. Abbiamo rilevato una piccola quantità di specie di SM isotopicamente etichettato come un composto standard a spillo in campioni biologici e ottenuto con successo una curva di calibrazione e la gamma quantitativa6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente metodo qualitativo, abbiamo ottenuto MS3 ioni prodotto di un SPC e un N-frazione di acil. È fondamentale per assegnare correttamente sia un SPC e un N-frazione di acil. A tal fine, si deve osservare che altre molecole contenenti fosforilcolina possono anche essere rilevati come gli ioni prodotto di3 MS. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e del plasmalogeno-PC sono abbondantemente presenti in cellule di mammifero, e loro idrofobicità è simile a quello della SM. Di consegue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) e una sovvenzione per lo studio del progetto di malattia intrattabile dal Ministero dell’economia Salute, lavoro e Welfare (K.Y. n. 201510032A). Ringraziamo il gruppo Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questo manoscritto.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
